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文檔簡介
1、目的:
1.體外分離培養(yǎng)多囊卵巢綜合征(PCOS)和非PCOS患者黃素化顆粒細(xì)胞并用卵泡刺激素受體(FSHR)免疫熒光鑒定;
2.探討二甲雙胍(Met)對PCOS黃素化顆粒細(xì)胞胰島素受體底物-1(IRS-1)及p-ser307-IRS-1的信使核糖核酸(mRNA)及蛋白表達(dá)水平的影響。
方法:
分離純化體外培養(yǎng)的PCOS和非PCOS組黃素化顆粒細(xì)胞用FSHR免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定;添加Met處理培養(yǎng)
2、為實驗組,添加類胰島素生長因子-1(IGF-1)為陽性對照組,15%FBS-M199培養(yǎng)基中加入與Met等量PBS培養(yǎng)為陰性對照組;通過RT-PCR和real-time PCR檢測分析IRS-1mRNA的表達(dá),細(xì)胞免疫熒光化學(xué)方法定性和Western-Blot定量檢測分析IRS-1及p-ser307-IRS-1蛋白表達(dá)。SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理如果p<0.05表示差異有顯著意義。
結(jié)果:
1.FSHR蛋白免疫細(xì)胞
3、化學(xué)染色是鑒定顆粒細(xì)胞的特異性標(biāo)記物,F(xiàn)SHR陽性染色定位于細(xì)胞胞漿和細(xì)胞膜,呈綠色熒光,細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光,鏡下可見FSHR的陽性率大于95%;
2.RT-PCR法擴(kuò)增出IRS-1的片段大小為134bp,real-time PCR分析結(jié)果顯示添加Met對PCOS組黃素化顆粒細(xì)胞IRS-1 mRNA表達(dá)顯著下調(diào),與陽性及陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05);
3.細(xì)胞免疫熒光化學(xué)檢測IRS-1及p-ser30
4、7-IRS-1蛋白陽性表達(dá)定位在顆粒細(xì)胞細(xì)胞質(zhì);
4.Western-blot檢測Met作用24h后卵巢黃素化顆粒細(xì)胞IRS-1及p-ser307-IRS-1蛋白表達(dá)下調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05),灰度值分析結(jié)果顯示PCOS組卵巢黃素化顆粒細(xì)胞IRS-1及p-ser307-IRS-1蛋白表達(dá)高于非PCOS組,添加Met組作用24h后PCOS組黃素化顆粒細(xì)胞IRS-1及p-ser307-IRS-1蛋白表達(dá)較非PCOS組顯
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