小鼠胚胎植入不同時(shí)期子宮內(nèi)膜蛋白質(zhì)組研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:胚胎侵入子宮內(nèi)膜的過程稱為著床或植入(implantation)。胚胎植入是一個(gè)復(fù)雜且精細(xì)的過程,涉及胚胎在子宮內(nèi)膜的粘附、侵入、發(fā)育分化以及子宮內(nèi)膜的同步化改變。胚胎發(fā)育到特定時(shí)期,子宮內(nèi)膜必須發(fā)生一系列復(fù)雜的變化,并且達(dá)到可容受狀態(tài),胚胎才能成功的植入,但至今對其機(jī)制尚不十分清楚。目前研究多僅限于單個(gè)蛋白質(zhì),不能解釋其整個(gè)復(fù)雜過程。 本研究利用蛋白質(zhì)組的相關(guān)技術(shù)分析小鼠胚胎植入不同時(shí)期子宮內(nèi)膜的蛋白質(zhì)差異,有助于從蛋白

2、質(zhì)組整體水平上探討胚胎植入的分子機(jī)制。 方法:1、建立MH小鼠妊娠動物模型,分離妊娠d3、d5、d7小鼠子宮內(nèi)膜組織。分別于-80℃凍存。2、雙向凝膠電泳(2-dimensional gel electrophoresis,2-DE)分別分離妊娠d3、d5、d7小鼠子宮內(nèi)膜組織蛋白質(zhì),考馬斯亮藍(lán)染色,PDQuest軟件進(jìn)行圖像分析。3、對12個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)用胰酶進(jìn)行膠內(nèi)酶切,基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MAIDI-'I'

3、OF-MS)分析酶切片斷,得到肽質(zhì)量指紋圖(PMF),使用國際互聯(lián)網(wǎng)上Matrix Science公司提供的PMF鑒定程序(Mascot:Peptide Mass Fingerprint)進(jìn)行查詢,每個(gè)查詢得到一個(gè)分值(Mowse Score),根據(jù)分值計(jì)算概率來評價(jià)每個(gè)檢索結(jié)果是否有意義。通??山邮艿挠蛑凳牵阂粋€(gè)事件隨機(jī)發(fā)生的概率小于5%,則該事件為有意義P<0.05)。4、收集孕d3、d5、d7小鼠子宮內(nèi)膜,采用RT-PCR、Wes

4、tern blowing技術(shù)測定Annexin A1 mRNA和Annexin A1的表達(dá)水平,并利用免疫組織化學(xué)法和原位雜交法分別定性檢測Annexin A1和Annexin A1 mRNA在小鼠子宮內(nèi)膜的分布情況,并對其作半定量分析。 結(jié)果: 1、2-DE圖譜顯示,小鼠子宮內(nèi)膜組織蛋白質(zhì)分子量(Mw)主要集中在14.4~116 kDa范圍內(nèi),等電點(diǎn)(Pi)主要分布在Ph4.0~8.0之間。比較孕3d、5d、7d不同時(shí)

5、期子宮內(nèi)膜蛋白質(zhì)考染圖譜(PDQuest7-3軟件分析圖像),結(jié)果顯示孕d3、d5、d7子宮內(nèi)膜蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜大體一致,其蛋白點(diǎn)分別為713個(gè)(d3)、736個(gè)(d5)、673個(gè)(d7)。以孕d5子宮內(nèi)膜2.DE圖譜為參考,孕d3、d7的2.DE圖譜與其匹配率分別為68%、61%。3倍以上差異表達(dá)蛋白總數(shù)為105個(gè):與孕d3子宮內(nèi)膜相比,孕d5表達(dá)上調(diào)3倍以上的蛋白點(diǎn)有24個(gè),表達(dá)下調(diào)3倍以上的蛋白點(diǎn)有7個(gè);與孕d7子宮內(nèi)膜相比,孕d5

6、表達(dá)上調(diào)3倍以上的蛋白點(diǎn)有32個(gè),表達(dá)下調(diào)3倍以上的蛋白點(diǎn)有19個(gè);與孕d7子宮內(nèi)膜相比,孕d3表達(dá)上調(diào)3倍以上的蛋白點(diǎn)有1 5個(gè),表達(dá)下調(diào)3倍以上的蛋白點(diǎn)有8個(gè)。 2、對12個(gè)差異候選蛋白點(diǎn)進(jìn)行MALDI-’FOF-MS鑒定,經(jīng)數(shù)據(jù)庫查詢,5個(gè)蛋白點(diǎn)獲得了有意義的結(jié)果p<0.05),分別為載脂蛋白A.I(Apo—AI)、膜聯(lián)蛋白A1(√‰exin A1)、谷光甘肽轉(zhuǎn)移酶(Glutathionetransferase omega

7、-1,GSTO1-1)、絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serine proteaseinhibitor A3M)、烯醇化酶(Alpha-enolase)。 3、RT-PCR、原位雜交、Western blotting和免疫組織化學(xué)方法分析均顯示Annexin A1基因表達(dá)和蛋白表達(dá)在孕d3較強(qiáng)、孕d5最強(qiáng)、孕d7最弱,其主要分布在妊娠小鼠子宮內(nèi)膜的腺上皮和腔上皮。 結(jié)論 1、 Apo-AI在胚胎植入前期即可被檢測到,并一直

8、持續(xù)到植入后期,提示Apo-Al對小鼠胚胎植入具有促進(jìn)作用;Annexin A1在d3和d5子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)明顯高于d7,提示該蛋白可能通過對細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)等多個(gè)途徑的調(diào)節(jié)促使子宮內(nèi)膜達(dá)到容受狀態(tài)而促進(jìn)胚胎植入;GSTO1-1可能通過對子宮內(nèi)膜局部免疫的調(diào)節(jié)而促進(jìn)胚胎植入;絲氨酸蛋白酶抑制劑A3M在胚胎植入前、中、后都有表達(dá),以d5為最強(qiáng),提示可能通過抑制蛋白酶的活性,防止基質(zhì)被過度降解,從而參與胚胎植入的調(diào)控;烯醇化酶在孕d3

9、表達(dá)最高,提示該蛋白可能參與了纖溶酶對細(xì)胞外基質(zhì)的降解,為滋養(yǎng)層細(xì)胞的浸潤做好準(zhǔn)備。 2、 Annexin A1在胚胎植入不同時(shí)期的小鼠子宮內(nèi)膜腺上皮、腔上皮均有表達(dá),且具有極強(qiáng)的時(shí)段性,以孕d5(植入窗口期)表達(dá)最強(qiáng)。由此推測Annexin A1可能參與了植入初期胚胎對子宮內(nèi)膜的粘附以及與胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲相關(guān)的蛻膜化改變。 3、本研究結(jié)果顯示,在小鼠胚胎圍著床期子宮內(nèi)膜組織差異表達(dá)的蛋白質(zhì)多為參與機(jī)體免疫反應(yīng)和子宮基質(zhì)

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