兩種鞘翅目昆蟲抗菌肽的分離純化與活性研究.pdf

1、抗菌肽是由基因編碼的一類小分子多肽，在昆蟲先天性免疫系統(tǒng)中占有重要地位，通常由10-50個(gè)氨基酸組成，多數(shù)為堿性、陽(yáng)離子肽，帶2-7個(gè)正電荷，具有水溶性好、熱穩(wěn)定性高、活性廣泛、細(xì)菌不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，極有可能成為新一代抗生素的替代藥物，因而成為生命科學(xué)、藥學(xué)和免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。昆蟲是自然界種類最多、數(shù)量最大的生物類群，同時(shí)也是抗菌肽未被充分挖掘的寶庫(kù)。從豐富的昆蟲資源中分離、提取和鑒定具有生物活性的抗菌肽或先導(dǎo)化合物是昆蟲抗菌肽

2、藥物研究和開發(fā)的重要步驟。
　　本論文以鞘翅目昆蟲黃粉蟲（Tenebrio molitor Linnaeus）幼蟲、喙尾琵甲（Blaps rhynchoptera Fairmaire）幼蟲為研究材料，通過(guò)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)和大腸桿菌(Escherichia coli)混合液針刺誘導(dǎo)使其產(chǎn)生抗菌肽，采用不同溶液對(duì)其體內(nèi)的抗菌肽進(jìn)行提取，經(jīng)多次凝膠色譜、反相色譜、高效液相色譜，成功地從黃粉蟲幼

3、蟲、喙尾琵甲幼蟲粗提物中獲得了具有明顯抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的小分子肽類，主要研究結(jié)果如下：
　　（1）抗菌肽最佳提取溶液的篩選：通過(guò)實(shí)驗(yàn)比較了10％乙酸溶液、0.1%三氟乙酸溶液、Tris-HCl（pH8.0）、Tris-HCl（pH6.5）等4種不同的溶液對(duì)黃粉蟲幼蟲抗菌肽的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10%乙酸粗提物和10%乙酸空白對(duì)照都有抑菌作用，導(dǎo)致對(duì)抑菌活性的歸屬產(chǎn)生嚴(yán)重干擾，因而不宜做提取溶液；其余3種提取液只有0.1%三氟乙酸提取

4、物經(jīng)后續(xù)凝膠柱預(yù)純化后，能夠檢測(cè)到明顯的抑菌活性，所以確定0.1%三氟乙酸作為2種昆蟲抗菌肽的最佳提取溶液。
　?。?）抗菌肽的預(yù)純化及 Tricine-SDS-PAGE：黃粉蟲幼蟲0.1%三氟乙酸粗提物經(jīng)SephadexG50凝膠層析后，非誘導(dǎo)組和誘導(dǎo)組均得到2個(gè)峰，其中第二個(gè)峰TFADZP2、TFAYDP2對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌表現(xiàn)出明顯的抑制作用，對(duì)大腸桿菌、綠膿桿菌無(wú)活性；喙尾琵甲幼蟲0.1%三氟乙酸粗提物經(jīng)Sup

5、erose12凝膠柱預(yù)純化后，非誘導(dǎo)組和誘導(dǎo)組均得到3個(gè)峰，其中第一個(gè)峰HWDZP1、HWYDP1對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌表現(xiàn)出抑制作用，對(duì)大腸桿菌無(wú)活性，此外誘導(dǎo)組HWYDP1還對(duì)綠膿桿菌表現(xiàn)出抑制作用；Tricine-SDS-PAGE結(jié)果表明，黃粉蟲幼蟲抗菌肽TFADZP2、TFAYDP2主要由分子量40 kD以下的小肽組成，喙尾琵甲抗菌肽HWDZP1、HWYDP1主要由分子量20 kD以下的小肽組成。
　　（3）抗菌肽

6、誘導(dǎo)組與非誘導(dǎo)組活性的比較：2種昆蟲誘導(dǎo)組和非誘導(dǎo)組粗提物經(jīng)純化后都能檢測(cè)到抑菌活性，而且誘導(dǎo)組在較低濃度時(shí)對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌圈直徑明顯大于非誘導(dǎo)組，抑菌活性較強(qiáng)，表明實(shí)驗(yàn)得到的2種昆蟲抗菌肽在體內(nèi)都有基礎(chǔ)表達(dá)，經(jīng)菌液誘導(dǎo)后活性有所增強(qiáng)。對(duì)喙尾琵甲來(lái)說(shuō)，誘導(dǎo)組還增加了對(duì)綠膿桿菌的抑制活性，說(shuō)明誘導(dǎo)可能導(dǎo)致抑菌譜擴(kuò)大。
　?。?）黃粉蟲抗菌肽的純化及鑒定：經(jīng)兩步Superdex Peptide凝膠色譜、一步反相色譜和一步高效液相色

7、譜，從黃粉蟲幼蟲誘導(dǎo)組純化出一個(gè)具革蘭氏陽(yáng)性菌抑制活性的組分，命名為TFAYDP2-2-1-1-2，液相色譜檢測(cè)純度為單一組分，質(zhì)譜顯示其分子量為2552.5Da，屬于小分子抗菌肽，該組分對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的最小抑制濃度分別為10μg/mL和20μg/mL，對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌、綠膿桿菌無(wú)活性。目前鞘翅目昆蟲還未見如此低分子量的抗菌肽報(bào)道。
　?。?）喙尾琵甲抗菌肽的純化：喙尾琵甲幼蟲誘導(dǎo)組預(yù)純化組分經(jīng)一步反相色譜純

8、化，得到組分HWYDP1-1，對(duì)金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制作用。
　　綜上所述，采用0.1%三氟乙酸作為黃粉蟲幼蟲抗菌肽的提取溶液，通過(guò)兩步凝膠柱層析、一步反相色譜和一步高效液相色譜從黃粉蟲幼蟲抗菌肽粗提物中獲得了一個(gè)純化組分，具有較強(qiáng)的抑制金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌活性，對(duì)這兩種革蘭氏陽(yáng)性菌的最小抑制濃度分別是10μg/mL和20μg/mL。但是該組分對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌、綠膿桿菌無(wú)活性；質(zhì)譜測(cè)定其分子量為2552.5Da