鹽敏感性高血壓及內(nèi)皮素-1對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量及功能的影響.pdf

1、研究背景： 本課題在DOCA/鹽大鼠高血壓模型上探討EPCs數(shù)目及功能的變化。目前的研究提示氧自由基對(duì)EPCs的存活和功能有著重要影響。更有研究在氧自由基增高的體外和體內(nèi)模型中發(fā)現(xiàn)端粒酶的活性影響了EPCs的存活。因此本課題檢測(cè)了DOCA/鹽高血壓大鼠EPCs氧自由基水平、凋亡百分率和端粒酶活性，以揭示在DOCA/鹽高血壓中EPCs功能異常的分子機(jī)制。此外，我們實(shí)驗(yàn)室以往的研究已經(jīng)證實(shí)了DOCA/鹽高血壓大鼠呈現(xiàn)明顯增強(qiáng)的氧化應(yīng)

2、激，ET-1可以通過(guò)ETA/NADPH氧化酶途徑增加血管壁上氧自由基的形成。在此基礎(chǔ)上，在本課題中我們?cè)隗w內(nèi)和體外使用了ETA受體的特異型拮抗劑和NADPH氧化酶的抑制劑來(lái)探討ETA受體和NADPH氧化酶在DOCA/鹽高血壓EPCs功能異常中的作用。 第一部分EPCs在DOCA/鹽大鼠中的水平及ET-1對(duì)EPC數(shù)量的影響 目的： 觀察DOCA/鹽大鼠體內(nèi)EPCs的水平變化及DOCN/鹽高血壓中的主要效應(yīng)激素ET-

3、1對(duì)正常EPCs數(shù)目的影響。 方法： 通過(guò)鼠尾袖帶動(dòng)脈測(cè)壓法(tail—cuff method)檢測(cè)DOCA/鹽大鼠及假手術(shù)大鼠的動(dòng)脈收縮壓，用Dil-acLDL/lectin雙染法和流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)EPC的水平，以探討EPC在DOCN鹽高血壓大鼠中的數(shù)目變化及ET-1對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞存活的影響。用免疫組化方法和Real time PCR的方法分別檢測(cè)EPCs上ETA和ETB受體蛋白和mRNA的表達(dá)。 結(jié)果：

4、1、DOCA/鹽處理4周后，DOCA/鹽大鼠的血壓顯著升高，與同時(shí)期的Sham組相比有顯著性差異。DOCA/鹽大鼠經(jīng)ETA受體特異性拮抗劑ABT—627或NADPH氧化酶的抑制劑Apocynin治療四周后，其血壓較DOCA/鹽高血壓大鼠有了明顯的改善。 2、DOCA/鹽高血壓大鼠的EPC數(shù)量較Sham組明顯降低。而在ABT—627或Apocynin治療的DOCA/鹽大鼠組里，EPC的數(shù)量較Sham組沒(méi)有明顯的改變。流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)

5、果也顯示在Sham組中CD34+細(xì)胞和Flk-1+細(xì)胞的比例分別為24.9±1.9％和15.6±2.2％。而DOCA/鹽高血壓大鼠中CD34+細(xì)胞和Flk-1+細(xì)胞的比例分別降到了14.5±3.8％和9.7±3.5％。 3、ET-1體外刺激正常大鼠EPCs達(dá)48小時(shí)后，EPCs數(shù)量明顯降低為了進(jìn)一步驗(yàn)證Ac—LDL/lectin雙染的結(jié)果，我們用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了CD34+和Flk-1+細(xì)胞的比例。流式的結(jié)果顯示ET-1處理48小

6、時(shí)后，CD34+細(xì)胞比例從31.5±3.2％降到18.27±4.8％；Flk-1+細(xì)胞比例從21.1±1.9％下降到16.3±0.7％。同樣的，在體外實(shí)驗(yàn)中，我們也證實(shí)了ABT—627或Apocynin都可以在體外逆轉(zhuǎn)ET-1所誘導(dǎo)的EPCs數(shù)目的降低。而ETB受體特異拮抗劑BQ788不能阻止ET-1所誘導(dǎo)的EPCs數(shù)量的降低。此外，EPCs在轉(zhuǎn)染了編碼功能負(fù)突變的Racl的腺病毒載體(adenoviral vector encodin

7、g dominant—negative Racl，DNRacl)后，也逆轉(zhuǎn)了ET-1所誘導(dǎo)的EPCs數(shù)目的降低(9.5±0.4 vs.10.1±0.3細(xì)胞/高倍視野(400×)，p>0.05 vs．control組)，而EPCs在轉(zhuǎn)染了β—gal后，沒(méi)有看到相同的效應(yīng)。 4、ETA和ETB受體的mRNA和蛋白均在外周血EPCs上表達(dá)。 第二部分DOCA/鹽大鼠EPCs中ROS水平及ET-1對(duì)EPCs中ROS的影響

8、 研究目的 觀察DOCA/鹽大鼠EPCs的ROS水平及ET-1對(duì)正常大鼠EPCs細(xì)胞內(nèi)ROS的影響。 研究方法： 通過(guò)Dichlorofluroescein(DCF)熒光顯微鏡技術(shù)測(cè)量EPCs細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，以探討DOCA/鹽大鼠EPCs中ROS的變化以及ET-1對(duì)正常EPCs中ROS的影響。 結(jié)果： 1、DOCA/鹽高血壓大鼠中EPCs的DCF熒光強(qiáng)度較Sham組的EPCs的熒光強(qiáng)度要大約1

9、.5倍(152±8.8％ vs.100±2.2％，*p＜0.05)。而DOCA/鹽大鼠經(jīng)ETA受體特異性拮抗劑ABT—627或NADPH氧化酶的抑制劑Apocynin治療四周后，其EPCs的DCF熒光強(qiáng)度較Sham組沒(méi)有明顯增強(qiáng)(107.6±8.8％，108.9±6.7％ vs.100±2.2％，p＞0.05)。 2、我們發(fā)現(xiàn)在外源性的氧自由基產(chǎn)生物質(zhì)LY83583刺激18小時(shí)后，來(lái)自DOCA/鹽高血壓大鼠的EPCs的DCF熒光

10、強(qiáng)度較棄基礎(chǔ)值有了明顯的升高(239±20.6％ vs.152±8.8％，＃p＜0.05)。而來(lái)自Sham組，ABT—627治療組和Apocynin治療組的EPCs對(duì)LY83583的反應(yīng)較基礎(chǔ)值沒(méi)有明顯改變。 3、ET-1培養(yǎng)48小時(shí)后，EPCs的ROS水平較對(duì)照組明顯升高了將近2倍(197.8±10.6％ vs.100.0±4.3％，*p＜0.05)。而在ABT—627或Apocynin預(yù)處理后，EPCs的ROS水平維持在對(duì)照

11、組的水平上(101.2±4.2％和108.7±4.2％ vs.100.0±4.3％，p＞0.05)。 第三部分DOCA/鹽大鼠EPCs的端粒酶活性和凋亡的變化及ET-1對(duì)EPCs端粒酶活性和凋亡的影響 研究目的： 探討DOCA/鹽大鼠EPCs的端粒酶活性和凋亡的變化及ET-1對(duì)EPCs端粒酶活性和凋亡的影響。 研究方法： 通過(guò)端粒重復(fù)擴(kuò)增—酶聯(lián)免疫法檢測(cè)EPCs的端粒酶，通過(guò)TUNEL檢測(cè)EPCs

12、凋亡百分率，以探討DOCA/鹽大鼠EPCs端粒酶活性和凋亡的情況以及ET-1對(duì)EPCs端粒酶活性和凋亡的影響。 結(jié)果： 1、DOCA/鹽高血壓大鼠的EPC端粒酶的活性與Sham組比較明顯降低了(154.5±33.7％ vs.456.1±42.5％，*p<0.05)；體內(nèi)用ABT—627或Apocynin治療后，端粒酶保持了原來(lái)的活性(367.4±30.2％，374.0±49.6％ vs.154.5±33.7％，p>0.0

13、5)。 2、DOCA/鹽高血壓大鼠的EPCs的凋亡比例較Sham組明顯增高(148.3±4.2％ vs.100.0±7.4％，*p<0.05)．DOCN鹽大鼠經(jīng)ETA受體特異性拮抗劑ABT—627或NADPH氧化酶的抑制劑Apocynin治療四周后，其EPCs發(fā)生凋亡的比例與Sham組比較沒(méi)有變化(104.7±14.7％和110.0±8.1％ vs.100.0±7.4％，p>0.05)。 3、用LY83583分別處理來(lái)源

14、于DOCA/鹽高血壓組，Sham組，DOCA/鹽+ABT—627治療組和DOCA/鹽+Apocynin治療組的EPCs18小時(shí)后，檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。如Fig所示，DOCA/鹽高血壓組的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的比例較基礎(chǔ)值明顯增多(206.7±14.0％ vs.148.3±4.2％，＃p<0.05)；而其它三組的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例礎(chǔ)值比較沒(méi)有明顯變化。 4、ET-1培養(yǎng)48小時(shí)后，EPC的端粒酶的活性較對(duì)照組明顯降低了約4倍(1

15、35.4±31.5％ vs.513.6±56.6％，*p<0.05)。而在ABT—627或Apocynin預(yù)處理后，EPC端粒酶的活性維持在對(duì)照組的水平上(507.1±116.9％，490.6±118.8％ vs.135.4±31.5％，p>0.05)。 5、ET-1培養(yǎng)48小時(shí)后，EPC的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例較對(duì)照組明顯升高了約1.6倍(166.8±7.6％ vs.100.0±5.6％，*p<0.05)。而在ABT—627或

16、Apocynin預(yù)處理后，EPC中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞維持存對(duì)照組的水平上(107.4±8.6％和102.8±6.6％ vs.100.0±5.6％，p>0.05)。 小結(jié)： 1、經(jīng)4周的DOCA/鹽處理后，DOCA/鹽大鼠的血壓顯著升高，但DOCA/鹽高血壓大鼠的EPCs的水平明顯降低。 2、DOCN/鹽高血壓大鼠EPCs的氧自由基的水平明顯升高，同時(shí)伴有凋亡百分率的增高和EPC端粒酶活性的降低。 3、DO

17、CA/鹽高血壓大鼠EPCs抗氧自由基的能力及DOCA/鹽高血壓大鼠EPCs抗氧自由基誘導(dǎo)的凋亡的能力明顯受損。 4、ETA和ETB受體的mRNA和蛋白均在外周血EPCs上表達(dá)。 5、ET-1可以在體外減少正常EPC的數(shù)量；明顯增加正常EPC細(xì)胞內(nèi)的氧自由基水平；ET-1在體外顯著抑制EPC端粒酶的活性并促進(jìn)正常EPC發(fā)生細(xì)胞凋亡： 6、ETA受體特異性拮抗劑或NADPH氧化酶抑制劑可以逆轉(zhuǎn)上述EPC體內(nèi)或體外效應(yīng)