人羊膜及臍帶來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷治療潛力的生物學(xué)特性比較.pdf

1、創(chuàng)傷性腦損傷（Traumatic brain injury，TBI）是一個(gè)世界性的公共衛(wèi)生問(wèn)題。TBI不僅具有較高的患病率和致死率，而且是繼發(fā)性癲癇發(fā)病的一個(gè)重要原因，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。在我國(guó)，TBI是40歲以下成年人創(chuàng)傷性死亡的主要原因。即使有幸存活下來(lái)一部分TBI也將造成嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺失和行為能力的障礙，給家庭和社會(huì)造成極大的負(fù)擔(dān)。目前臨床主要采用對(duì)癥支持療法，另外采用積極的院前復(fù)蘇、快速分流、重癥監(jiān)護(hù)也有助于降低死亡率，但

2、這些治療方法仍不能達(dá)到令人滿意的效果。TBI在病理生理學(xué)上可分為原發(fā)性腦損傷和繼發(fā)性腦損傷兩個(gè)階段。首先原發(fā)性的機(jī)械性創(chuàng)傷會(huì)對(duì)局部的神經(jīng)組織造成損害，而損傷本身隨后又會(huì)觸發(fā)一連串的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括神經(jīng)組織缺血、繼發(fā)于彌漫性軸索損傷的Wallerian變性、興奮毒性、鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)、線粒體功能障礙和自由基介導(dǎo)的損傷等。繼發(fā)性的腦損傷常發(fā)生在頭部受傷后的數(shù)小時(shí)到數(shù)天的時(shí)間內(nèi)。而且TBI之后神經(jīng)元的喪失不僅僅發(fā)生在損傷局部而且可以彌散到其它腦區(qū)。局

3、灶性損傷典型的特征是損傷區(qū)周?chē)幕屹|(zhì)內(nèi)或灰白質(zhì)交界處的出血。這種局灶性的神經(jīng)元死亡有兩種機(jī)制，迅速的細(xì)胞壞死和進(jìn)程較慢的細(xì)胞調(diào)亡。彌漫性損傷則主要發(fā)生在海馬區(qū)神經(jīng)元，海馬區(qū)的神經(jīng)元對(duì)TBI的反應(yīng)尤為敏感，在所有致命的TBI患者中有超過(guò)80％存在海馬區(qū)神經(jīng)元的大量喪失，即使在沒(méi)有顱高壓存在的情況下亦是如此。這造成的直接后果便是導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或患者記憶和認(rèn)知功能的損害。當(dāng)前對(duì)TBI治療方法的研究主要基于以上對(duì)繼發(fā)性腦損傷的病理生理、分子和細(xì)胞

4、機(jī)制的認(rèn)識(shí)，包括占位性病變的早期發(fā)現(xiàn)和清除防止二次損傷，并嘗試通過(guò)藥物來(lái)減輕生化和細(xì)胞級(jí)聯(lián)反應(yīng)造成的損害。人們普遍認(rèn)為，成年人在損傷后刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生將可能需要一個(gè)或多個(gè)以下的進(jìn)程:細(xì)胞更換、提供神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、促進(jìn)軸突導(dǎo)向和去除抑制軸突生長(zhǎng)的因素、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)控、橋接和材料、和/或調(diào)節(jié)的免疫反應(yīng)。自從20年前哺乳動(dòng)物大腦的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞具有自我更新的能力被證實(shí)以來(lái)，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的研究熱點(diǎn)逐漸轉(zhuǎn)入對(duì)神經(jīng)生物學(xué)的研究，

5、例如細(xì)胞替代療法已經(jīng)成為研究和商業(yè)活動(dòng)的一大焦點(diǎn)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，基于干細(xì)胞移植的治療方法可能是用于治療TBI后功能障礙的最有前途的治療策略之一。細(xì)胞替代療法以如下的治療理念為基礎(chǔ)，即創(chuàng)傷或疾病所引起的神經(jīng)功能缺失可以通過(guò)引入新的細(xì)胞來(lái)替代喪失的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，或者所引進(jìn)細(xì)胞通過(guò)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用來(lái)增加受損的神經(jīng)細(xì)胞的存活、可塑性和功能的恢復(fù)來(lái)發(fā)揮作用。迄今為止各種類型的干細(xì)胞，包括胚胎干細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞目前正在被用于移植

6、研究來(lái)治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESC）移植對(duì)大鼠的腦損傷功能恢復(fù)有治療作用，但是移植后的腫瘤形成限制了它在人體當(dāng)中的應(yīng)用。另外胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用存在明顯道德倫理障礙和胎兒組織來(lái)源不足等問(wèn)題。最新的研究顯示誘導(dǎo)多能干細(xì)胞induced pluripotent stem cells，iPS）具有ESC的全能性，但是它同樣存在體內(nèi)形成腫瘤的危險(xiǎn)。神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells，

7、NSC)是一個(gè)用來(lái)移植治療腦損傷理想的種子細(xì)胞，它既可以分化成神經(jīng)細(xì)胞又可以分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，但是大量神經(jīng)干細(xì)胞的來(lái)源問(wèn)題目前為止仍然限制了它的應(yīng)用。人間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)被認(rèn)為是一個(gè)很好作為腦損傷移植治療的備選細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)和臨床研究中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrowmesenchymal stem cells，BM-MSC)是目前使用最廣泛的種子細(xì)胞。然而抽取骨髓是一個(gè)具有高

8、度侵入性的過(guò)程中，存在疼痛和感染的風(fēng)險(xiǎn)，而且其分化的潛能和擴(kuò)增能力都會(huì)隨著年齡的增加而降低。因此尋找BM-MSC的替代細(xì)胞已經(jīng)成為一個(gè)研究方向。來(lái)自胎盤(pán)，胎膜，羊水或胎兒組織細(xì)胞在細(xì)胞數(shù)量、擴(kuò)張潛力和分化能力上都較成體組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞更高。而且它們當(dāng)中的一些細(xì)胞已經(jīng)被用來(lái)研究治療神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)創(chuàng)傷性疾病。盡管胎盤(pán)來(lái)源的某些間充質(zhì)干細(xì)胞已經(jīng)被用來(lái)研究其對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型的治療作用，但是目前仍不清楚圍生期組織來(lái)源的各

9、種細(xì)胞對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療作用是否相同。在本研究中，我們將重點(diǎn)比較人羊膜來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞（amniotic membrane mesenchymal stem cells，AM-MSC）和臍帶華通膠來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord Wharton's jelly mesenchymal stem cells，WJ-MSC)的生物學(xué)特性，比較它們的形態(tài)、體外擴(kuò)增能力、免疫表型、和多能性。鑒于神經(jīng)干細(xì)胞是用來(lái)移植治療TBI一

10、個(gè)最理想的種子細(xì)胞，我們還比較了這兩種間充質(zhì)干細(xì)胞的體外神經(jīng)分化潛能，哪種細(xì)胞越容易的分化成神經(jīng)干細(xì)胞，它就越適合作為治療TBI的種子細(xì)胞。細(xì)胞移植治療TBI，除了細(xì)胞替代以外，移植細(xì)胞提供的旁分泌功能也起到一定的作用。MSC被移植到腦損傷區(qū)域后可以提高損傷局部的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子濃度，這對(duì)受損細(xì)胞的存活和分化具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)中我們使用人細(xì)胞因子抗體芯片檢測(cè)兩種來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的507個(gè)細(xì)胞因子的表達(dá)。同時(shí)在兩種間充質(zhì)干細(xì)胞的神經(jīng)干的誘

11、導(dǎo)過(guò)程中，我們?cè)隗w外檢測(cè)了對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和重建具有關(guān)鍵作用的5個(gè)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。它們是腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derivedneurotrophic factor，BDNF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3（neurotrophin3，NT-3）、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（glial cell derivedneurotrophic factor，GDNF）和睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(cil

12、iary neurotrophic factor，CNTF)。這一結(jié)果將在一定程度上對(duì)于TBI損傷修復(fù)中種子細(xì)胞的選擇提供一定的參考，尤其是在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌方面。同時(shí)這也反映神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)過(guò)程對(duì)不同細(xì)胞分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子能力的影響。另一方面移植入體內(nèi)干細(xì)胞的存活能力也是干細(xì)胞移植治療需要考慮的重要方面。間充質(zhì)干細(xì)胞的移植治療效果往往被植入細(xì)胞的大量損失所限制，細(xì)胞的死亡是由于損傷部位的惡劣微環(huán)境所引發(fā)。本研究中我們通過(guò)過(guò)氧化氫和去血清培

13、養(yǎng)兩種方式來(lái)模擬過(guò)氧化應(yīng)激和局部的缺血缺氧環(huán)境，并比較了兩種來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞體外的抗凋亡能力?？沟蛲瞿芰?qiáng)的干細(xì)胞更適合體內(nèi)移植治療TBI。本研究包括三個(gè)部分：
　　 第一部分：AM-MSC和WJ-MSC的分離、培養(yǎng)和鑒定。
　　 目的：建立一種簡(jiǎn)單有效的分離培養(yǎng)AM-MSC和WJ-MSC的方法，觀察其形態(tài)，檢測(cè)其表面抗原標(biāo)記的表達(dá)情況，觀察培養(yǎng)過(guò)程中核型的變化，比較兩種細(xì)胞體外增殖能力，觀察其表面的細(xì)微結(jié)構(gòu)，并檢測(cè)它們

14、中胚層多向分化能力。
　　 方法：對(duì)與羊膜細(xì)胞的分離我們采用2.4 U/mL中性蛋白酶、1.0 mg/mL膠原酶A和0.01 mg/mL脫氧核糖核酸酶依次消化來(lái)分離;對(duì)于華通膠細(xì)胞的分離我們采用Ⅱ型膠原酶和0.125％胰酶/EDTA依次消化的方法來(lái)分離。通過(guò)光學(xué)顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并通過(guò)原子力顯微鏡(atomic force microscope，AFM)對(duì)細(xì)胞表面的細(xì)微結(jié)構(gòu)進(jìn)行掃描。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)兩種分離得到的細(xì)胞的

15、表面抗原進(jìn)行檢測(cè)，并通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)的方法對(duì)其表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志的情況進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)測(cè)定體外累積群體倍增來(lái)對(duì)兩種細(xì)胞體外增殖能力進(jìn)行比較，并對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行核型分析。我們對(duì)兩種MSC的中胚層多向分化能力進(jìn)行的檢測(cè)，包括向骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的分化能力。
　　 結(jié)果：通過(guò)上述的方法我們成功的分離培養(yǎng)出AM-MSC和WJ-MSC。兩種細(xì)胞都呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣貼壁生長(zhǎng)，相比之下WJ-MSC形態(tài)更加細(xì)長(zhǎng)并具有更加強(qiáng)的折光性。對(duì)細(xì)

16、胞表面抗原檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞的表達(dá)情況相類似，它們表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面抗原(CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105)，不表達(dá)血液和內(nèi)皮系統(tǒng)的表面抗原（CD19、CD31、CD34和CD45），表達(dá)Ⅰ類抗原HLA-ABC但不表達(dá)Ⅱ類抗原HLA-DR。通過(guò)對(duì)兩種細(xì)胞向中胚層多向分化能力的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞都能夠向骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞方向分化。以上結(jié)果與國(guó)際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的定義和標(biāo)準(zhǔn)相符合，這說(shuō)明

17、我們從上述組織中分離出的細(xì)胞符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特性。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示兩種細(xì)胞都強(qiáng)烈表達(dá)波形蛋白(100.00±0.00％ vs.100.00±0.00％)，少量的AM-MSC和WJ-MSC表達(dá)nestin(28.73±2.97％ vs.19.22±2.96％,t=2.265,P=0.053)、sox2(20.58±2.43％ vs.21.11±2.51％,t=0.154,P=0.881)和Musashi1(10.17±3.10％

18、vs.12.62±2.58％，t=0.609，P=0.559)，兩組之間nestin在AM-MSC中陽(yáng)性率較高但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AFM掃描結(jié)果顯示，AM-MSC具有更強(qiáng)的粘附能力，在細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程中邊緣胞體有更長(zhǎng)的偽足伸出，這提示其可能具有更強(qiáng)的遷移能力。體外擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，WJ-MSC具有更高的體外增殖能力（F=817.948，P＜0.001）。在細(xì)胞培養(yǎng)的各個(gè)階段我們都對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了核型分析，未發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)對(duì)其正常核型的產(chǎn)生影響。

19、
　　 結(jié)論：我們成功分離出AM-MSC和WJ-MSC，分離出的細(xì)胞符合MSC的標(biāo)準(zhǔn)，包括表面抗原的表達(dá)情況和中胚層多向分化的能力。AM-MSC具有更強(qiáng)的粘附能力，并可能有更強(qiáng)的體內(nèi)遷移能力;而WJ-MSC則具有更強(qiáng)的體外增殖能力。兩種細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下都能保持正常的二倍體核型。
　　 第二部分：AM-MSC和WJ-MSC向神經(jīng)干細(xì)胞分化能力的比較。
　　 目的：建立一種誘導(dǎo)AM-MSC和WJ-MSC分化為神經(jīng)

20、干細(xì)胞的方法。通過(guò)這種方法我們想找到神經(jīng)干細(xì)胞的新的來(lái)源，另外我們比較兩種來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞的分化能力。檢測(cè)在誘導(dǎo)過(guò)程中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)量的變化情況。
　　 方法：間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的方法如下:AM-MSC和WJ-MSC培養(yǎng)在神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基含有KnockOutTM DMEM/F-12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、20 ng/mL人上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(human epidermal growth factor，EG

21、F)、20 ng/mL人成纖維細(xì)胞細(xì)胞生長(zhǎng)因子(human beta fibroblastic growth factor，bFGF)、神經(jīng)干細(xì)胞添加劑StemPro(@) NSC SFM和GlutaMAXTM-Ⅰ添加劑(1∶100)同時(shí)含有1％的青鏈霉素，在37℃和5％ CO2置于25 cm2超低粘附力表面的培養(yǎng)瓶中。每3天更換一次新鮮培養(yǎng)基。誘導(dǎo)10天后，收集神經(jīng)球通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和酶聯(lián)免疫吸(enzyme-linked immu

22、noadsordent assay，ELISA)附實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：AM-MSC和WJ-MSC可以被誘導(dǎo)成神經(jīng)球（一種神經(jīng)干細(xì)胞的生長(zhǎng)方式），羊膜來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞（amnion derived neural stem cells，AM-NSC）和臍帶華通膠來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞(umbilical cord Warton's jelly derived neural stemcells，AM-NSC)。而

23、且這種誘導(dǎo)得到的神經(jīng)球具有神經(jīng)干細(xì)胞的大部分特征。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示AM-MSC和WJ-MSC經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)之后表達(dá)三種神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志。經(jīng)過(guò)神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)之后與未誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞相比，神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志表達(dá)明顯上調(diào)。細(xì)胞免疫化學(xué)具體結(jié)果如下:AM-NSC與AM-MSC相比表現(xiàn)更強(qiáng)的nestin、sox2和musashi熒光信號(hào)(nestin，92.05±2.75％vs.28.73±2.97％,P＜0.001;sox2,70.17

24、±3.16％ vs.20.58±2.43％,P＜0.001;Musashi(l)，66.94±3.62％ vs.10.17±3.10％，P＜0.001）;WJ-NSC與WJ-MSC相比表現(xiàn)更強(qiáng)的nestin、sox2和musashi熒光信號(hào)（nestin，83.57±2.60％ vs.19.22±2.96％,P＜0.001; sox2,71.17±3.63％ vs.21.11±2.51％,P＜0.001; Musashi,64.15±3

25、.81％ vs.12.62±2.58％，P＜0.001）。有意思的是誘導(dǎo)后AM-NSC與WJ-NSC相比表現(xiàn)更強(qiáng)的nestin熒光信號(hào)但sox2和musashi未見(jiàn)顯著差異(nestin，92.1±2.82％ vs.83.6±22.52％,P=0.0497; sox2,70.2±3.26％ vs.71.2±3.54％，P=0.816; Musashi1，67.0±3.67％ vs.64.0±3.89％，P=0.559）。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)

26、果和Western blot結(jié)果與免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果一致。對(duì)兩種來(lái)源細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞在誘導(dǎo)前后分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的能力的變化情況進(jìn)行的檢測(cè)。我們檢測(cè)了BDNF、GDNF、NT-3、CNTF和NGF。具體的ELISA結(jié)果如下:AM-MSC分泌因子的情況，BDNF，109.51±15.26 pg/mL，GDNF32.85±14.21 pg/mL, NT-327.43±11.91 pg/mL, CNTF39.62±13.56 pg/mL和NGF

27、21.46±9.83 pg/mL;誘導(dǎo)之后AM-NSC分泌因子情況，BDNF，477.39±39.95 pg/mL, GDNF101.01±11.67 pg/mL, NT-3206.33±26.36 pg/mL, CNTF160.48±22.69 pg/mL和NGF185.23±23.59 pg/m。WJ-MSC分泌因子情況，BDNF,241.69±25.90pg/mL, GDNF16.21±10.01 pg/mL, NT-3172.3

28、5±25.20pg/mL，CNTF34.37±11.42 pg/mL和NGF105.59±18.24 pg/mL;誘導(dǎo)之后WJ-NSC分泌因子情況，BDNF，333.66±31.59 pg/mL，GDNF93.64±19.17pg/mL，NT-3122.46±20.02 pg/mL，CNTF231.28±22.07 pg/mL和NGF32.76±10.17 pg/mL。組間比較結(jié)果顯示誘導(dǎo)前WJ-MSC與AM-MSC相比表達(dá)高的BDNF

29、(P=0.006)、NT-3(P＜0.001)和NGF(P=0.002)。而有意思的是誘導(dǎo)后AM-NSC卻比WJ-NSC表達(dá)更高的BDNF(P=0.003)、NT-3(P=0.015)、CNTF(P=0.014)和NGF(P=0.009)。實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果與上述的ELISA結(jié)果一致。
　　 結(jié)論：成功的將AM-MSC和WJ-MSC誘導(dǎo)為AM-NSC和WJ-NSC。這些誘導(dǎo)得到的NSC與未誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞相比表達(dá)更高的NSC

30、標(biāo)志。誘導(dǎo)之前WJ-MSC和AM-MSC相比表達(dá)更多的BDNF、NT-3和NGF，然而誘導(dǎo)之后AM-NSC卻比WJ-NSC表達(dá)更高的BDNF、NT-3、CNTF和NGF。由此可見(jiàn)來(lái)自新生兒附屬組織不同部位的間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)同一神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)方法的反應(yīng)不完全相同，相比之下AM-MSC對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)的反應(yīng)更有利于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的分泌。
　　 第三部分：AM-MSC和WJ-MSC體外細(xì)胞因子抗體芯片檢測(cè)和抗凋亡能力的檢測(cè)。
　　

31、 目的：運(yùn)用人細(xì)胞因子抗體芯片對(duì)兩種來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的能力進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)過(guò)氧化氫和去血清培養(yǎng)誘導(dǎo)AM-MSC和WJ-MSC凋亡，并檢測(cè)其抗凋亡能力。
　　 方法：使用人細(xì)胞因子抗體芯片(Human L-507 Array，RayBiotech Inc.)檢測(cè)兩種間充干細(xì)胞所分泌的507種細(xì)胞因子。我們用化學(xué)發(fā)光的方法來(lái)探測(cè)膜上的信號(hào)強(qiáng)度，信號(hào)的強(qiáng)度通過(guò)光密度計(jì)來(lái)進(jìn)行定量。對(duì)于數(shù)值差別在兩倍以上的因子，我們對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)

32、學(xué)分析。我們選用陽(yáng)性對(duì)照對(duì)來(lái)自各張膜的數(shù)值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。本實(shí)驗(yàn)中采用2 mmol/L的H2O2和去血清培養(yǎng)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞以末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸生物素缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)和Annexin V和propidine碘(PI)染色來(lái)進(jìn)行測(cè)定。
　　 結(jié)果：細(xì)胞因子抗體芯片的結(jié)果如下:與WJ-MSC相比AM-MSC中檢測(cè)到有23種細(xì)胞因子高表達(dá)差異倍數(shù)在兩倍以上;而在WJ-MSC中有49種細(xì)胞因子

33、相對(duì)AM-MSC高表達(dá)差異倍數(shù)在兩倍以上。在AM-MSC中高表達(dá)的23種細(xì)胞因子中，有4種因子差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而在WJ-MSC中兩倍以上高表達(dá)的49種因子，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在AM-MSC中上調(diào)的4種因子為白細(xì)胞介素(interleukin，IL)或者白細(xì)胞介素的受體。具體的細(xì)胞因子如下:IL-6(t=3.546, P=0.038), IL-13 Ralpha2(t=3.336,P=0.045), IL-12 p70(t

34、=3.743,P=0.033), IL-22 R(t=3.187，P=0.0498)。H2O2誘導(dǎo)凋亡后，TUNEL法檢測(cè)AM-MSC和WJ-MSC細(xì)胞凋亡率(27.94±2.31％ vs.35.70±2.27％，t=2.401，P=0.043)，Annexin V/PI染色方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率(31.31±2.05％ vs.39.52±2.65％，t=2.448，P=0.040);去血清培養(yǎng)誘導(dǎo)凋亡后，Annexin V/PI染色方法檢