UVB輻射表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和UVA輻射真皮成纖維細(xì)胞在皮膚光老化中的作用機(jī)理研究.pdf

1、人體皮膚接受的日光紫外線輻射主要為UVA和UVB。皮膚光老化的分子機(jī)制之一，是UVA和UVB通過激活細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞MMPs的基因轉(zhuǎn)錄。皮膚光老化為UVA和UVB共同作用的結(jié)果：一方面，UVA和UVB誘導(dǎo)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞表達(dá)和分泌MMPs，對真皮的細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)揮降解作用；另一方面，UVA誘導(dǎo)真皮成纖維細(xì)胞合成和分泌出細(xì)胞因子IL-6，通過自分泌機(jī)制促進(jìn)其自身表達(dá)MMPs；更為重要的是，

2、UVB誘導(dǎo)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞合成和分泌出細(xì)胞因子IL-1、TNF-α、IL-6等，通過旁分泌機(jī)制促進(jìn)真皮成纖維細(xì)胞表達(dá)MMPs。在以往的研究中，常將UVA或UVB對皮膚光老化的影響及其分子機(jī)制分開研究，很少有研究在同一個試驗中同時采用UVA和UVB。本實驗的前三部分均以UVA和UVB的共同作用為基礎(chǔ)而設(shè)計。光老化的另一可能分子機(jī)制，是UV輻射對真皮成纖維細(xì)胞膠原合成能力的影響。本實驗的第四部分就UVA對體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞膠原合成的影響以及

3、EGCG對此的防護(hù)作用做了研究。 研究目的：一、皮膚光老化的分子機(jī)制之一，是UVA和UVB的共同作用誘導(dǎo)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞表達(dá)MMPs。旁分泌機(jī)制在其中起著重要的作用，就此開展了三方面研究： 1.同時采用UVA和UVB，研究旁分泌機(jī)制對皮膚光老化發(fā)生的影響機(jī)制。即模擬紫外線對人體皮膚的作用方式，研究UVB輻射HaCaT的培養(yǎng)上清對UVA輻射真皮成纖維細(xì)胞表達(dá)MMP-1的影響機(jī)制。 2.在旁分泌機(jī)制的

4、細(xì)胞因子中選擇關(guān)鍵的因子IL-1，研究IL-1α和IL-1β對UVA輻射成纖維細(xì)胞表達(dá)MMPs的影響機(jī)制。 3.選擇IL-1作為可能的作用靶位，研究IL-1受體拮抗劑(IL-1Ra)對這種旁分泌機(jī)制的拮抗作用及作用環(huán)節(jié)。 二、光老化的另一可能分子機(jī)制，是UV輻射對真皮成纖維細(xì)胞膠原合成能力的影響。因此，本試驗還研究了UVA對體外培養(yǎng)的人真皮成纖維細(xì)胞膠原合成的影響并探討表沒食子兒茶酚沒食子酸酯(EGCG)對此影響的防護(hù)作

5、用。 研究方法：1.用Western免疫印跡方法檢測成纖維細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的活性表達(dá)。2.用RT-PCR方法檢測C-Jun、C-Fos和Ⅰ、ⅢI型前膠原的mRNA表達(dá)。3.用ELISA方法檢測培養(yǎng)上清液中MMP-1，MMP-2的表達(dá)。4.在試驗的第三部分中，用實時熒光定量RT-PCR方法(熒光染料摻入法)檢測C-Jun、C-Fos及內(nèi)參照GAPDHmRNA的表達(dá)變化。5.應(yīng)用光度檢測法測定可溶性膠原羥脯氨酸的含

6、量。 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1.不同劑量UVB(0、1、5、10、15mJ/cm2)輻射的HaCaT培養(yǎng)上清以劑量依賴方式促進(jìn)UVA(10J/cm2)輻射成纖維細(xì)胞表達(dá)MAPK活性和C-JunmRNA。與UVB0mJ/cm2比較，UVB15mJ/cm2輻射的HaCaT培養(yǎng)上清使UVA(10J/cm2)輻射成纖維細(xì)胞表達(dá)C-JunmRNA顯著增高(P＜0.05)，但對表達(dá)C-FosmRNA無顯著性影響。經(jīng)由低到高劑量的UVB輻射HaCaT

7、的培養(yǎng)上清處理后，UVA(10J/cm2)輻射成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清中MMP-1的分泌呈增高趨勢，且于用UVB15mJ/cm2輻射的HaCaT培養(yǎng)上清處理時顯著增高(t=8.413，P=0.014)。在加入UVB(15mJ/cm2)輻射的HaCaT培養(yǎng)上清的處理組中，UVA(10J/cm2)輻射成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清中的MMP-1分泌漸增高，24小時為0小時的2.4倍(t=8.427，P=0.014)。 2.不同劑量UVA(0，1，5，

8、10J/cm2)輻射的成纖維細(xì)胞分泌MMP-1逐漸上升，對MMP-2分泌沒有影響。加入IL-1α和IL-1β(0，1，10，100ng/ml)促進(jìn)UVA(10J/cm2)輻射成纖維細(xì)胞表達(dá)MAPK活性，并以劑量依賴方式促進(jìn)其表達(dá)C-JunmRNA。IL-1α還顯著增加UVA(10J/cm2)輻射成纖維細(xì)胞表達(dá)c-FosmRNA，但I(xiàn)L-1β對表達(dá)c-FosmRNA無明顯影響。分別與力加入IL-1α0ng/ml和IL-1β0ng/ml比較

9、，加入100ng/m1IL-1α和IL-1β促進(jìn)UVA輻射成纖維細(xì)胞分泌MMP-1，且均有顯著性差異(P均＜0.05)，但對UVA輻射成纖維細(xì)胞分泌MMP-2無明顯影響。 3.UVA(10J/cm2)輻射的成纖維細(xì)胞在加入不同劑量UVB(0、1、5、10、15mJ/cm2)輻射HaCaT的培養(yǎng)上清后其MMP-1的分泌呈增高趨勢。與加入UVB0mJ/cm2輻射HaCaT的培養(yǎng)上清比較，加入UVB15mJ/cm2輻射HaCaT的培養(yǎng)

10、上清時，UVA(10J/cm2)輻射的成纖維細(xì)胞分泌MMP-1有顯著性差異(t=8.413，P=0.014)。而加入IL-1Ra以劑量依賴方式抑制用UVB15mJ/cm2輻射HaCaT的培養(yǎng)上清處理的UVA(10J/cm2)輻射成纖維細(xì)胞分泌MMP-1。統(tǒng)計C-Jun和C-Fos的初始拷貝數(shù)以及其與GAPDH初始拷貝數(shù)的比值，結(jié)果顯示IL-1Ra以劑量依賴方式抑制用UVB15mJ/cm2輻射HaCaT的培養(yǎng)上清處理的UVA(10J/cm

11、2)輻射成纖維細(xì)胞表達(dá)C-JunmRNA，對表達(dá)C-FosmRNA則無顯著性影響。 4.不同劑量UVA(1、5、10J/cm2)輻射降低成纖維細(xì)胞表達(dá)Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA及其培養(yǎng)液中羥脯氨酸的含量。UVA(10J/cm2)輻射后成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中羥脯氨酸量于6小時最低，而后逐漸增高于48小時恢復(fù)至正常水平。力加入EGCG以劑量依賴方式提高UVA(10J/cm2)輻射的成纖維細(xì)胞表達(dá)Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA及其培養(yǎng)液中羥脯氨酸的含

12、量。與0mg/mL比較，加入EGCG0.1mg/mL時成纖維細(xì)胞表達(dá)Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA及其培養(yǎng)液中羥脯氨酸的含量均有顯著性差異(P均＜0.05)。 結(jié)論：1.模擬環(huán)境中UVB和UVA對人體皮膚的作用方式，同時采用UVA和UVB。結(jié)果表明UVB輻射角質(zhì)形成細(xì)胞以旁分泌方式，通過促進(jìn)UVA輻射真皮成纖維細(xì)胞表達(dá)MAPK活性和C-JunmRNA來促進(jìn)其表達(dá)MMP-1，表明這種旁分泌機(jī)制在皮膚光老化的真皮膠原過度降解中發(fā)揮著重要的作

13、用。2.UVA輻射成纖維細(xì)胞分泌MMP-1增加，對分泌MMP-2沒有影響。細(xì)胞因子IL-1(IL-1α和IL-1β)通過促進(jìn)UVA輻射成纖維細(xì)胞表達(dá)MAPK活性和c-JunmRNA，IL-1α還促進(jìn)其表達(dá)c-FosmRNA使UVA輻射成纖維細(xì)胞表達(dá)MMP-1增加，表明IL-1在皮膚光老化的真皮膠原過度降解中發(fā)揮著重要的作用。3.UVB輻射的HaCaT培養(yǎng)上清以旁分泌方式促進(jìn)UVA輻射的成纖維細(xì)胞分泌MMP-1。IL-1Ra通過抑制用UV