Involucrin和ECM在銀屑病和硬皮病表皮角質(zhì)形成細(xì)胞及真皮成纖維細(xì)胞中的比較研究.pdf

1、[研究背景]
　　銀屑病是一種由多基因遺傳決定的、多環(huán)境因素刺激誘導(dǎo)的免疫異常性慢性炎癥性增生性皮膚病，其特征是表皮的過度增生、角化異常、血管新生、免疫激活與炎癥反應(yīng)。而系統(tǒng)性硬皮病是一種結(jié)締組織性疾病，以膠原纖維的過度增生、血管改變和抗多種細(xì)胞抗原的自身抗體的產(chǎn)生為主要特征。兩種疾病的發(fā)病機(jī)制都尚未明確，但研究表明都與促炎癥的細(xì)胞因子，如白介素（Interleukin，IL）、血管內(nèi)皮生長因子（vascularendotheli

2、algrowthfactor，VEGF）、轉(zhuǎn)移生長因子（transforminggrowthfactor，TGF）、腫瘤壞死因子（tumornecrosisfactor,TNF）等有關(guān)。
　　眾所周知，銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞存在角化過度和角化異常，但具體機(jī)制尚不十分明確。同時，最新研究表明，硬皮病角質(zhì)形成細(xì)胞也存在角化延遲。Involucrin是角質(zhì)形成細(xì)胞終分化的早期標(biāo)志，在正常人表皮中主要表達(dá)于棘細(xì)胞上層和顆粒層。而在銀屑病患者的

3、表皮中，Involucrin位于除基底細(xì)胞層和角質(zhì)層的表皮全層，表達(dá)量也大大增加。Involucrin在硬皮病表皮內(nèi)的表達(dá)和分布尚無相關(guān)的報道。
　　另一方面，硬皮病成纖維細(xì)胞的激活是造成真皮內(nèi)膠原沉積的主要原因，因此長期以來對硬皮病的研究焦點在于真皮的成纖維細(xì)胞。TGF-β是最強(qiáng)大的促纖維化的細(xì)胞因子之一，在慢性纖維化疾病中參與成纖維細(xì)胞的激活，在膠原生產(chǎn)中起到關(guān)鍵作用。VEGF參與硬皮病發(fā)病，在硬皮病患者血清和皮膚受累部位含量

4、都增加。然而，這些促炎癥的細(xì)胞因子是如何通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用的尚不明確。
　　銀屑病研究的主要靶細(xì)胞是表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，有研究表明，皮膚成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的相互作用是銀屑病發(fā)病機(jī)制之一。由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的VEGF和血管生成素是銀屑病血管新生和功能異常的主要原因。銀屑病患者體內(nèi)過表達(dá)TGF-β1，而對(K5.TGFβ1)野生型轉(zhuǎn)基因鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，此轉(zhuǎn)基因鼠皮膚產(chǎn)生了銀屑病樣的炎癥反應(yīng)。但這些促炎癥的細(xì)胞因子對銀屑病成纖

5、維細(xì)胞的作用和相關(guān)機(jī)制的研究尚不充分。
　　因此，我們采用銀屑病、硬皮病和正常人的角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為研究對象，探討炎癥細(xì)胞因子在銀屑病和硬皮病發(fā)病機(jī)制中的作用和可能的機(jī)制。
　　[目的]
　　明確在銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞中存在角化異常的機(jī)制;闡明硬皮病角質(zhì)形成細(xì)胞中角化延遲的原因以及可能的信號傳導(dǎo)通路的作用;明確導(dǎo)致銀屑病成纖維細(xì)胞功能異常的相關(guān)分子及可能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用;闡明硬皮病成纖維細(xì)胞異常激活的相關(guān)分子

6、及相關(guān)機(jī)制。
　　[方法]
　　第一部分:間接免疫熒光法檢測Involucrin在正常表皮和銀屑病皮損的表達(dá)和定位;分離和培養(yǎng)正常人和銀屑病患者表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，以WesternBlot法比較Involucrin在正常人和銀屑病患者表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá);將炎癥細(xì)胞因子（如IL-13、IL-17A、TNF-α等）及ERK1/2和GSK-3β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑與體外培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞共孵育，以WesternBlot法比較炎癥細(xì)

7、胞因子和信號通路抑制劑對Involucrin在正常人和銀屑病患者表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)的影響。
　　第二部分:間接免疫熒光法檢測Involucrin在正常表皮和硬皮病皮損的表達(dá)和定位;分離和培養(yǎng)正常人和硬皮病患者表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，以間接免疫熒光法檢測Involucrin在細(xì)胞中的表達(dá)和定位;與炎癥細(xì)胞因子（IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF-α、TGF-β1、ET-1、IL-13、IFN-γ、VEGF

8、165、PDGF-BB）共培養(yǎng)，以WesternBlot法比較炎癥細(xì)胞因子對Involucrin在正常人和硬皮病患者表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)的影響;將炎癥細(xì)胞因子（IL-13、ET-1和IFN-γ等）及Rho信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑與體外培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞共孵育，以WesternBlot法比較炎癥細(xì)胞因子和信號通路抑制劑對Involucrin在正常人和硬皮病患者表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)的影響。
　　第三部分:分離和培養(yǎng)正常人和硬皮病患者真皮

9、成纖維細(xì)胞，以WesternBlot法比較炎癥細(xì)胞因子（VEGF165、IFN-γ和TGF-β）及ERK1/2和GSK-3β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑對FN、CTGF和pAKT蛋白在正常人、銀屑病和硬皮病患者真皮成纖維細(xì)胞中表達(dá)的影響。
　　[結(jié)果]
　　1Involucrin在銀屑病表皮和正常表皮的表達(dá)和調(diào)控:
　　1)在正常表皮中，Involucrin主要表達(dá)于顆粒層和棘細(xì)胞上層，而在銀屑病皮損區(qū)表皮中，Involucri

10、n表達(dá)于除基底層和角質(zhì)層外的表皮各層細(xì)胞;
　　2)體外培養(yǎng)的銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞和正常角質(zhì)形成細(xì)胞相比，中Involucrin的表達(dá)明顯升高;
　　3)在體外培養(yǎng)的銀屑病和正常角質(zhì)形成細(xì)胞中，當(dāng)ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路或GSK-3β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制后，Involucrin蛋白的表達(dá)都明顯增加;
　　4)IL-13、IL-17A、ET-1、TNF-α、IFN-γ均可促進(jìn)銀屑病患者與正常對照原代培養(yǎng)的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中In

11、volucrin蛋白的表達(dá)。然而，銀屑病與正常對照的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞對不同細(xì)胞因子的反應(yīng)不同;
　　5)ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被抑制后，IL-13（只在正常對照角質(zhì)形成細(xì)胞中）、IL-17A、ET-1、TNF-α和IFN-γ不能促進(jìn)銀屑病與正常表皮角質(zhì)形成細(xì)胞Involucrin蛋白的表達(dá)。在銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞中，IL-13甚至可以抑制Involucrin蛋白的表達(dá);
　　6)在正常角質(zhì)形成細(xì)胞中，當(dāng)GSK-3β被抑制后，

12、IL-13、ET-1和TNF-α仍然可以促進(jìn)Involucrin蛋白的表達(dá)，而IL-17A和IFN-γ可降低Involucrin蛋白的表達(dá)。在銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞中，IL-17A和IFN-γ可以顯著降低Involucrin蛋白的表達(dá)，而IL-13、ET-1和TNF-α對銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞Involucrin蛋白的表達(dá)沒有作用。
　　2Involucrin在硬皮病表皮和正常表皮的表達(dá)和調(diào)控:
　　1)在正常對照表皮和硬皮病患者表

13、皮中，Involucrin局限在顆粒層和棘細(xì)胞上層，基底層和基底上棘細(xì)胞層沒有表達(dá);
　　2)體外培養(yǎng)的硬皮病角質(zhì)形成細(xì)胞與正常角質(zhì)形成細(xì)胞相比，Involucrin的表達(dá)明顯下降;
　　3)體外培養(yǎng)的正常角質(zhì)形成細(xì)胞Involucrin主要位于核周，而硬皮病角質(zhì)形成細(xì)胞中Involucrin主要位于核內(nèi)。同時，在硬皮病角質(zhì)形成細(xì)胞中，Involucrin的熒光輕度明顯減低;
　　4)在正常角質(zhì)形成細(xì)胞中，IL-6、I

14、(I)-10、IL-17A、TNF-α，尤其是TGF-β1、ET-1、IFN-γ、VEGF165和PDGF-BB，可以促進(jìn)Involucrin蛋白的表達(dá)。而在硬皮病角質(zhì)形成細(xì)胞中，IL-1β、IL-6、IL-10、TGF-β1、ET-1、IFN-γ、VEGF165和PDGF-BB可降低Involucrin蛋白的表達(dá)，而IL-4、IL-17A、TNF-α可促進(jìn)Involucrin蛋白的表達(dá);
　　5)Rho信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對硬皮病和正常

15、人體外培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞Involucrin蛋白的表達(dá)無影響;
　　6)抑制Rho信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可以逆轉(zhuǎn)IFN-γ對正常角質(zhì)形成細(xì)胞Involucrin的促表達(dá);而在硬皮病角質(zhì)形成細(xì)胞則可以逆轉(zhuǎn)IL-13對Involucrin的促表達(dá)，同時可以進(jìn)一步促進(jìn)IFN-γ對Involucrin蛋白表達(dá)的抑制作用。
　　3ECM在銀屑病、硬皮病患者和正常人皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)和調(diào)控:
　　1)TGF-β1可上調(diào)銀屑病、硬皮病和

16、正常人皮膚成纖維細(xì)胞FN的表達(dá)，且不受ERK1/2和GSK-3β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響;
　　2)VEGF165可上調(diào)銀屑病和正常人皮膚成纖維細(xì)胞FN的表達(dá)，但對硬皮病成纖維細(xì)胞FN表達(dá)無作用;ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被抑制后，VEGF165可促進(jìn)硬皮病成纖維細(xì)胞FN蛋白的表達(dá);GSK-3β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被抑制后，VEGF165對正常成纖維細(xì)胞FN蛋白的作用被逆轉(zhuǎn);
　　3)IFN-γ可上調(diào)正常人皮膚成纖維細(xì)胞FN的表達(dá)，但對銀屑

17、病和硬皮病成纖維細(xì)胞FN表達(dá)無作用;ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被抑制后，IFN-γ可極大促進(jìn)正常成纖維細(xì)胞FN蛋白的表達(dá);GSK-3β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被抑制后，IFN-γ由促進(jìn)轉(zhuǎn)為抑制正常成纖維細(xì)胞FN的表達(dá)，同時可促進(jìn)銀屑病成纖維細(xì)胞FN表達(dá);
　　4)TGF-β1可極大促進(jìn)銀屑病、硬皮病和正常CTGF的表達(dá)，而VEGF165r和IFN-γ則對CTGF蛋白的表達(dá)沒有作用。當(dāng)ERK1/2和GSK-3β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被抑制后，TGF-β1仍

18、促進(jìn)CTGF蛋白的表達(dá)，VEGF165和IFN-γ仍對CTGF蛋白的表達(dá)沒有作用;
　　5)VEGF165可上調(diào)正常人皮膚成纖維細(xì)胞AKT的磷酸化，但對銀屑病和硬皮病成纖維細(xì)胞AKT的磷酸化無作用;ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被抑制后，VEGF165可增加銀屑病和硬皮病成纖維細(xì)胞AKT的活性;GSK-3β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被抑制后，VEGF165可抑制正常人和銀屑病成纖維細(xì)胞AKT的活性;
　　6)IFN-γ可上調(diào)銀屑病和正常人皮膚成

19、纖維細(xì)胞AKT的磷酸化;ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被抑制后，IFN-γ可增加硬皮病成纖維細(xì)胞AKT的活性;GSK-3β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被抑制后，IFN-γ可抑制銀屑病成纖維細(xì)胞AKT的活性;
　　7)TGF-β1可極大促進(jìn)銀屑病、硬皮病和正常皮膚成纖維細(xì)胞AKT的磷酸化，且不受ERK1/2和GSK-3β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。
　　[結(jié)論]
　　1、銀屑病表皮和原代培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞Involucrin的表達(dá)均增加;
　　

20、2、ERK1/2和GSK-3β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可抑制表皮的異常角化;
　　3、細(xì)胞因子IL-13、IL-17A、ET-1、TNF-α和IFN-γ可通過ERK1/2和GSK-3β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)銀屑病和正常對照角質(zhì)形成細(xì)胞Involucrin蛋白的表達(dá);
　　4、ERK1/2和GSK-3β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞因子IL-13、IL-17A、ET-1、TNF-α和IFN-γ調(diào)節(jié)銀屑病和正常對照角質(zhì)形成細(xì)胞Involucrin蛋白的表達(dá)上

21、作用不同;
　　5、硬皮病表皮的終分化是延遲的;
　　6、硬皮病表皮終分化延遲可能與硬皮病患者血清或皮損內(nèi)炎癥細(xì)胞因子，如IL-4、IL-6、IL-10、TGF-β1、ET-1、FN-γ、VEGF165和PDGF-BB的水平升高有關(guān);
　　7、Rho信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對正常和硬皮病角質(zhì)形成細(xì)胞Involucrin蛋白表達(dá)沒有作用，但可以影響IFN-γ和IL-13對Involucrin蛋白的調(diào)節(jié);
　　8、VEGF165