表皮干細(xì)胞、毛乳頭細(xì)胞復(fù)合脫細(xì)胞真皮基質(zhì)移植修復(fù)裸鼠皮膚缺損創(chuàng)面的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目前，自體皮源不足仍是救治大面積燒傷病人的一個(gè)難題。體外重建皮膚移植是目前人們最感興趣的解決辦法之一，近年來(lái)，利用不同的真皮支架(如脫細(xì)胞真皮基質(zhì)、膠原凝膠、膠原海綿、羥乙酸乳酸聚酯等)與自體薄層皮片或培養(yǎng)的表皮細(xì)胞復(fù)合移植覆蓋皮膚缺損，在臨床和實(shí)驗(yàn)中均有成功的報(bào)道。 本課題組從2000年開(kāi)始系統(tǒng)研究組織工程皮膚的構(gòu)建，成功的以胰酶消化法分離、培養(yǎng)出表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞，研制出異種(豬)脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，并初步完成表皮干細(xì)胞復(fù)合脫

2、細(xì)胞真皮基質(zhì)構(gòu)建組織工程皮膚的工作。在研究工作中，我們發(fā)現(xiàn)胰酶法消化分離的表皮細(xì)胞混雜有成纖維細(xì)胞，影響表皮細(xì)胞純度和活性；脫細(xì)胞真皮基質(zhì)與表皮干細(xì)胞復(fù)合構(gòu)建的人工皮膚具有血管化速度慢、移植成活率低等缺點(diǎn)；為了克服以上缺點(diǎn)，我們進(jìn)一步對(duì)表皮細(xì)胞的消化、分離方法，人工皮膚構(gòu)建方法進(jìn)行了研究，在真皮基質(zhì)中引入一種新的具有干細(xì)胞特性的活性細(xì)胞—毛乳頭細(xì)胞，對(duì)其促進(jìn)人工皮膚血管化作用進(jìn)行了研究，本實(shí)驗(yàn)共分五部分： 第一部分：不同消化方法

3、對(duì)表皮細(xì)胞表面抗原α6整合素和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達(dá)的影響 目的比較不同消化方法對(duì)表皮細(xì)胞表面抗原α6整合素和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(CD71)表達(dá)的影響，為消化、分離表皮干細(xì)胞選擇合適的方法。方法分為胰酶組和中性蛋白酶聯(lián)合胰酶組兩種方法消化、分離表皮細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，以熒光標(biāo)記的α6整合素和CD71抗體標(biāo)記細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析兩種抗原表達(dá)，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果①兩組細(xì)胞活力比較：中性蛋白酶組細(xì)胞活力明顯高于胰酶組[(86

4、±1.81)，(82±1.48)％，P＜0.01]。②兩組細(xì)胞抗原表達(dá)：胰酶組α6briCD71dim細(xì)胞占(8±1.69)％，α6briCD71bri細(xì)胞占(36±18.03)％，α6dim細(xì)胞占(40±10.08)％；中性蛋白酶組3種細(xì)胞所占比例依次為(30±8.59)，(8±1.63)和(38±8.72)％，兩組抗原表達(dá)基本相似(P＞0.05)。③兩組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果：胰酶組細(xì)胞貼壁及伸展較中性蛋白酶組稍遲0.5～1.0h，此后培養(yǎng)過(guò)

5、程中生長(zhǎng)增殖情況無(wú)明顯差異。培養(yǎng)過(guò)程中可見(jiàn)夾雜有成纖維細(xì)胞。中性蛋白酶組細(xì)胞未見(jiàn)夾雜有成纖維細(xì)胞。結(jié)論①中性蛋白酶聯(lián)合胰酶消化方法對(duì)細(xì)胞活力影響小。②兩種酶對(duì)表皮細(xì)胞表面抗原α6整合素和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達(dá)無(wú)影響。③中性蛋白酶聯(lián)合胰酶消化方法獲得表皮細(xì)胞純度高，細(xì)胞貼壁、伸展迅速，適用于消化、分離表皮干細(xì)胞。 第二部分：表皮干細(xì)胞培養(yǎng)、分選及鑒定 目的探討表皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)、擴(kuò)增及表皮干細(xì)胞的分選方法，為組織工程皮膚構(gòu)建提供

6、理想的種子細(xì)胞。方法中性蛋白酶消化法分離表皮細(xì)胞，以角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。取第2，3代細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組以涂被100μg/mlⅣ型膠原的培養(yǎng)瓶進(jìn)行黏附分選。對(duì)照組細(xì)胞未經(jīng)黏附分選。以免疫熒光、流式細(xì)胞儀等檢測(cè)兩組細(xì)胞中干細(xì)胞比例、細(xì)胞周期及活力，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，體積小，均勻一致，核漿比例大，免疫熒光檢測(cè)同時(shí)表達(dá)K19、β1整合素，表達(dá)α6整合素、不表達(dá)CD71。α6briCD71dim細(xì)胞占(43.660±1.17)％，G

7、0/G1細(xì)胞為(94.367±1.319)％，與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。細(xì)胞活力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組為(92.083±1.225)％，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論Ⅳ型膠原黏附分選法能夠?yàn)榻M織工程皮膚構(gòu)建提供純度高、細(xì)胞活力好的種子細(xì)胞。 第三部分：胎兒毛乳頭細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定和體外誘導(dǎo)分化 目的探討胎兒毛乳頭細(xì)胞的生物學(xué)特性、體外誘導(dǎo)分化潛能及作為組織工程皮膚種子細(xì)胞的可行性。方法以Ⅰ型

8、膠原酶消化法分離毛乳頭，在DMEM/F12(3∶1)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，通過(guò)免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)等方法，對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。取第3、7代細(xì)胞以成脂誘導(dǎo)液、成骨誘導(dǎo)液體外定向誘導(dǎo)7～10d，油紅染色和VonKossa染色、骨橋蛋白免疫熒光檢測(cè)鑒定細(xì)胞的成脂和成骨特性。結(jié)果體外培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞表達(dá)平滑肌動(dòng)蛋白、Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原、層粘連蛋白和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，成脂誘導(dǎo)10d后油紅染色可見(jiàn)紅色脂滴形成，成骨誘導(dǎo)7d后VonKossa染色

9、有黑色鈣結(jié)節(jié)形成，細(xì)胞表達(dá)骨橋蛋白。結(jié)論體外培養(yǎng)毛乳頭細(xì)胞具有干細(xì)胞特性，可作為皮膚組織工程和骨組織工程一種新的種子細(xì)胞。 第四部分：組織工程皮膚真皮支架的組織相容性檢測(cè) 目的探討異體脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的組織相容性，為組織工程皮膚構(gòu)建選取理想的真皮支架。方法以正常人體真皮組織作為對(duì)照，通過(guò)體外、體內(nèi)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ADM的組織相容性，以膨脹度、飽和含水量及生物力學(xué)分析檢測(cè)ADM的親水性及機(jī)械性能。結(jié)果真皮基質(zhì)中未見(jiàn)任何細(xì)胞成

10、分，其網(wǎng)孔直徑介于100～180μm之間。實(shí)驗(yàn)組，飽和含水量為(69.6±3.97)％。膨脹度(2.3±0.42)，最大斷裂力為(3.082±0.046)N，與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。體內(nèi)外細(xì)胞毒性檢測(cè)，未見(jiàn)明顯細(xì)胞生長(zhǎng)抑制及免疫排斥反應(yīng)。結(jié)論脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)機(jī)械性能接近正常皮膚，組織相容性好，免疫排斥反應(yīng)小，是構(gòu)建組織工程皮膚理想的真皮材料。 第五部分：表皮干細(xì)胞、毛乳頭細(xì)胞復(fù)合脫細(xì)胞真皮基質(zhì)移植修復(fù)裸

11、鼠皮膚缺損創(chuàng)面的實(shí)驗(yàn)研究 目的探討毛乳頭細(xì)胞對(duì)表皮干細(xì)胞與脫細(xì)胞真皮基質(zhì)構(gòu)建的皮膚替代物血管化和生物性能的影響。方法以異體脫細(xì)胞真皮基質(zhì)為支架，在真皮支架皮下組織側(cè)種植毛乳頭細(xì)胞，真皮乳頭側(cè)種植表皮干細(xì)胞構(gòu)建皮膚替代物，對(duì)照組不予種植毛乳頭細(xì)胞。將兩種人工皮膚移植修復(fù)裸鼠背部皮膚缺損創(chuàng)面，通過(guò)組織學(xué)、生物力學(xué)等檢測(cè)對(duì)體外培養(yǎng)和在體裸鼠背部創(chuàng)面移植后兩種皮膚替代物進(jìn)行比較。結(jié)果毛乳頭組人工皮膚表皮層較對(duì)照組厚，實(shí)驗(yàn)組2W、4W血管

12、密度分別為(38.56±2.491)個(gè)/mm2和(49.12±2.391)個(gè)/mm2，高于對(duì)照組，二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；移植4W后毛乳頭組皮膚收縮率(3.94±0.013)％，對(duì)照組為(29.07±0.018)％，二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；生物力學(xué)檢測(cè)，毛乳頭細(xì)胞組、對(duì)照組的應(yīng)力-應(yīng)變曲線較正常裸鼠皮膚組曲線依次向上(左)偏離。最大斷裂力毛乳頭組為(1.835±0.035)N，對(duì)照組(1.075±0.06