自體脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合脫細(xì)胞真皮基質(zhì)修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、由于負(fù)重關(guān)節(jié)面由透明軟骨組成，軟骨細(xì)胞被細(xì)胞外基質(zhì)包繞，幾乎沒有遷徙能力，不能聚集到創(chuàng)傷部位，因此，軟骨組織一旦發(fā)生損傷后自我修復(fù)能力十分有限。軟骨缺損常常引起關(guān)節(jié)疼痛及功能障礙甚至殘疾，臨床上缺乏有效的治療方法，從而促進(jìn)了軟骨組織工程技術(shù)地快速發(fā)展。軟骨組織工程涉及種子細(xì)胞、支架材料及生長因子、信號(hào)分子和應(yīng)力作用等環(huán)境方面的內(nèi)容。其中種子細(xì)胞是影響組織工程學(xué)的重要因素。脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose-derived mesen

2、chymal stem cells，ADMSCs）由于其強(qiáng)大的增殖和分化能力做為組織工程的種子細(xì)胞來源而備受關(guān)注。
　　 目的：
　　 1.探討脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞分離和培養(yǎng)的可行性，為擴(kuò)大和優(yōu)化軟骨組織工程種子細(xì)胞源提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 2.自體脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞與脫細(xì)胞真皮基質(zhì)（acellular derma matrix，ADM）復(fù)合修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損，對(duì)修復(fù)組織進(jìn)行組織學(xué)和組織病理學(xué)評(píng)分，評(píng)價(jià)修復(fù)

3、效果，為臨床應(yīng)用組織工程學(xué)方法修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損提供理論依據(jù)和奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 選用健康新西蘭兔36只。剪碎的兔脂肪組織使用0.1％Ⅰ型膠原酶消化離心后獲得自體ADMSCs后進(jìn)行體外培養(yǎng)。流式細(xì)胞儀檢測ADMSCs表面抗原CD44的表達(dá)情況。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。取原代、第3代ADMSCs，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定細(xì)胞生長曲線。
　　 體外特定條件下誘導(dǎo)ADMSCs定向誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞及軟

4、骨細(xì)胞。ADMSCs成脂方向誘導(dǎo)組成為DMEM，10％FBS，異丁基甲基黃嘌呤（IBMX），200μmol/L地塞米松，10μg/ml胰島素，1μmol/L吲哚美辛。ADMSCs成骨方向誘導(dǎo)組成為DMEM，10％FBS，0.1μmol/L地塞米松，50μg/mL抗壞血酸，10mmol/Lβ-磷酸甘油。ADMSCs成軟骨誘導(dǎo)組成包括10％FBS、高糖DMEM、10μg/L轉(zhuǎn)化生長因子β1、50μg/ml抗壞血酸、6.25 mg/L胰島素。

5、ADMSCs成脂誘導(dǎo)分化后用油紅O染色，成骨方向誘導(dǎo)分化后用鈷鈣法堿性磷酸酶染色及茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色，成軟骨方向誘導(dǎo)分化后進(jìn)行Ⅱ型膠原免疫組化染色。使用特殊染色來證明ADMSCs的多向分化潛能。
　　 用小牛真皮制備ADM作為細(xì)胞載體，ADMSCs體外培養(yǎng)至第3代，制成濃度為5×105/ml的軟骨細(xì)胞懸液。將自體ADMSCs與ADM體外復(fù)合培養(yǎng)2d后，行掃描電鏡觀察后，移植于兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損處。
　　 將36只新西蘭兔隨機(jī)

6、分為ADMSCs/ADM實(shí)驗(yàn)組、ADM對(duì)照組和空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組髁間窩軟骨缺損處植入ADMSCs/ADM，ADM對(duì)照組單純植入脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，空白對(duì)照組不作任何植入，分別于術(shù)后6周、9周和12周每組各處死4只動(dòng)物，取材對(duì)修復(fù)組織進(jìn)行大體、組織學(xué)及免疫組化染色觀察，根據(jù)關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)評(píng)分及組織病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)修復(fù)組織進(jìn)行評(píng)分，數(shù)據(jù)輸入SPSS 16.0軟件，用隨機(jī)分組的SNK-q法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，比較各組的評(píng)分差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

7、>　　 結(jié)果：
　　 1.接種24h后可見兔ADMSCs呈長梭形或多邊形貼壁。細(xì)胞增殖迅速，原代培養(yǎng)約10～14d左右可以達(dá)到80-90％融合。
　　 2.ADMSCs表面抗原的鑒定：流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示細(xì)胞表面抗原CD44呈陽性表達(dá)。
　　 3.ADMSCs生長曲線呈“S”形。貼壁2 d后細(xì)胞開始增殖，7d進(jìn)入增殖高峰期，9 d后進(jìn)入平臺(tái)期。
　　 4.ADMSCs成脂誘導(dǎo)分化后經(jīng)油紅染色顯示分泌紅

8、色脂滴的脂肪細(xì)胞：成骨誘導(dǎo)分化后堿性磷酸酶染色呈黑色沉淀，茜素紅染色呈鈣化結(jié)節(jié)；成軟骨誘導(dǎo)分化后Ⅱ型膠原免疫組化染色陽性。
　　 5.電鏡下可見ADM呈多孔疏松結(jié)構(gòu)，孔隙率較好，適合ADMSCs生長。
　　 6.術(shù)后9周ADMSCs/ADM實(shí)驗(yàn)組大體觀察修復(fù)組織整合較好，無支架材料殘留。ADM對(duì)照組和空白對(duì)照組為纖維性修復(fù)和無修復(fù)。組織學(xué)評(píng)分ADMSCs/ADM實(shí)驗(yàn)組與ADM對(duì)照組和空白對(duì)照組差別有顯著性意義（P<0.0

9、5），ADM對(duì)照組與空白對(duì)照組差別無顯著性意義（P>0.05）；組織病理學(xué)評(píng)分顯示ADMSCs/ADM實(shí)驗(yàn)組與ADM對(duì)照組和空白對(duì)照組差別有顯著性（P<0.05），ADM對(duì)照組與空白對(duì)照組無顯著性差異（P>0.05）。
　　 7.術(shù)后12周ADMSCs/ADM實(shí)驗(yàn)組大體觀察修復(fù)組織表面光滑，與周圍軟骨整合良好。ADM對(duì)照組和空白對(duì)照組為纖維性修復(fù)和無修復(fù)。組織學(xué)評(píng)分ADMSCs/ADM實(shí)驗(yàn)組與.ADM對(duì)照組和空白對(duì)照組差別有顯著

10、性（P<0.05），ADM對(duì)照組與空白對(duì)照組差別有顯著性（P<0.05）；組織病理學(xué)評(píng)分顯示ADMSCs/ADM實(shí)驗(yàn)組與ADM對(duì)照組和空白對(duì)照組差別有顯著性（P<0.05），ADM對(duì)照組與空白組差別有顯著性（P<0.05）。
　　 8.Ⅱ型膠原免疫組化染色顯示ADMSCs/ADM實(shí)驗(yàn)組修復(fù)區(qū)的軟骨細(xì)胞含Ⅱ型膠原，與周圍軟骨結(jié)合良好。
　　 結(jié)論：
　　 1.兔脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在體外具有生長穩(wěn)定，增殖較快的