菘藍(lán)中4-香豆酰輔酶A連續(xù)酶家族的功能研究.pdf

1、4-香豆酰輔酶A連接酶是苯丙素類生源合成途徑上一個關(guān)鍵酶，是苯丙烷代謝途徑的最后一個酶，在苯丙烷代謝途徑中處于終端位置，催化4-香豆酸生成4-香豆酰輔酶A。在植物中，4-香豆酰輔酶A連接酶多以多基因家族的形式存在。
　　 本課題從我國傳統(tǒng)藥用植物菘藍(lán)Isatis indigotica Fort.中，采用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)的方法，克隆獲得菘藍(lán)中4-香豆酰輔酶A連接酶家族中的

2、Ii4CL2、Ii4CL3全長cDNA。Ii4CL2（Genbank accession No.KC430622）cDNA全長為1975bp，編碼564個氨基酸;Ii4CL3(Genbank accession No.KC430623)cDNA全長為1932 bp，編碼543個氨基酸。另外，克隆獲得Ii4CL1全長cDNA為1967bp(Genbank accession No.GU937875)，包含一個1632 bp的開放閱讀框(O

3、RF)，編碼543個氨基酸殘基。生物信息學(xué)分析表明，4CLs可分為不同的類群，將Ii4CL2、Ii4CL3歸為ClassⅡ,主要地伴隨木質(zhì)素以及其他苯丙烷類衍生物的生物合成，而Ii4CL1則歸為ClassⅠ和ClassⅡ之外的ClassⅢ，此類型的4CL作用偏離木質(zhì)素以及其他苯丙烷類衍生物的生物合成。
　　 利用實時定量PCR考察4CL家族各基因在菘藍(lán)不同器官組織中的表達(dá)情況，Ii4CL1在根中的表達(dá)水平最高;Ii4CL2在根中

4、的表達(dá)水平最高;而Ii4CL3在花中的表達(dá)水平最高。三條基因均能響應(yīng)甲基茉莉酸和紫外線誘導(dǎo)，表達(dá)量都有不同程度的提高。通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察了Ii4CL1、Ii4CL2和Ii4CL3融合蛋白的亞細(xì)胞定位情況，均定位在胞質(zhì)溶膠中。
　　 經(jīng)IPTG低溫誘導(dǎo)后，分離純化獲得4CL家族各成員的蛋白，體外酶活測定相關(guān)酶動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明，菘藍(lán)中各4CL具有不同的底物選擇性。Ii4CL2可與4-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸催化結(jié)

5、合，且催化能力均較強;Ii4CL3能與咖啡酸、阿魏酸催化結(jié)合， Ii4CL1與5種底物均不能催化結(jié)合。
　　 以發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1為介導(dǎo)，成功建立了菘藍(lán)發(fā)根培養(yǎng)體系;并且采取過量和抑制表達(dá)兩種策略對菘藍(lán)中4CL家族各成員進行轉(zhuǎn)基因操作，通過對菘藍(lán)野生型發(fā)根和抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因事件的發(fā)根中落葉松脂素生物合成途徑上的基因表達(dá)和目標(biāo)化合物的積累水平進行分析。抑制表達(dá)Ii4CL1基因后，合成途徑上基因的表達(dá)量有少量提高，同時，落葉松脂素的

6、含量只有小幅度的無規(guī)則變化。抑制表達(dá)Ii4CL2基因后，轉(zhuǎn)基因株系中4CL1的表達(dá)量有1.5倍左右的上調(diào)，4CL3的表達(dá)量大約是WT株系的2-3倍，PLR的表達(dá)量也有3倍左右幅度的上調(diào)。而3個株系中落葉松脂素的含量都有一定幅度的提高，最高含量是野生型的2.5倍。抑制表達(dá)Ii4CL3基因后，4CL1的表達(dá)量有2倍左右的上調(diào)，4CL2的表達(dá)量上升，大約是WT株系的5倍，PLR的表達(dá)量大約下調(diào)至WT株系的0.6倍。但是，落葉松脂素的含量有所降