棉花肉桂酰輔酶A還原酶基因(GhCCR4)的遺傳轉化和功能分析.pdf

1、棉花是世界上最重要的天然纖維作物，棉花在我國國民經濟中占有十分重要的地位。近年來，克隆與棉纖維次生壁加厚發(fā)育相關的基因，從分子水平改良棉纖維品質已成為主要研究方向。肉桂酰輔酶A還原酶(Cinnamoyl-CoA Reductase，CCR)是苯丙烷代謝途徑中的一個關鍵酶，此酶可能對苯丙烷代謝途徑的碳流具有潛在的調控作用。 為了明確棉花CCR基因的基本功能和對木質素含量的影響，我們利用已經從棉花中克隆的木質素生物合成的限速酶基因-

2、肉桂酰輔酶A還原酶基因(GhCCR4)，構建其瞬時表達載體，通過基因槍法轉化棉花胚珠，研究基因表達對棉纖維發(fā)育的影響。然后利用農桿菌浸染法轉化棉花，分析了GhCCR4的功能。實驗結果如下： 1)實驗構建了由CaMV35S啟動子驅動的pGUS-CCR4融合表達載體，使用基因槍轟擊法將其轉化棉花胚珠，確定了轉化0 DPA胚珠的最佳條件：轟擊壓力為1350 psi，轟擊距離為9 cm，轟擊次數為2次。GUS組織化學染色結果表明，GhC

3、CR4基因在棉花纖維伸長期和次生壁增厚期持續(xù)表達。不同發(fā)育時期纖維長度測量結果發(fā)現，在8d時轉GhCCR4基因纖維長度和對照相比沒有明顯差別，但在27 d時纖維長度明顯短于對照。纖維透射電鏡切片觀察發(fā)現，轉GhCCR4基因的細胞次生壁與對照相比增厚達17％。上述結果說明，GhCCR4基因在纖維細胞中的表達對棉花纖維的伸長起到了抑制作用并能夠使細胞壁次生壁在一定程度上增厚。 2)對棉花莖尖農桿菌介導轉化的多個因素進行了比較，完善了

4、的農桿菌莖尖轉化體系。在以農桿菌介導的棉花轉化過程中，應以2天的無菌苗莖尖作為農桿菌的感染受體，激素的最佳配比濃度為KT0.5 mg]L、IAA0.1 mg/L，莖尖長勢相對較好，出芽率最高；卡那霉素的最適篩選濃度為50 mg/L；扦插生根的方法能夠縮短再生植株生育周期。使用上述方法，篩選抗性轉化率達到35％以上，轉化周期縮短至2-3個月。 3)利用農桿菌介導法獲得了批量的抗性幼苗，為避免假陽性植株的出現，首先進行了卡那霉素點涂

5、和GUS化學檢測，獲得陽性植株；以CaMV35S啟動子和NPTII報告基因序列設計引物，進行陽性植株PCR擴增，PCR檢測的陽性率在30％左右。使用抗性篩選和分子檢測相結合的方法，獲得了12株轉基因棉花。同時利用半定量PCR方法進行了轉錄水平的檢測，發(fā)現他們與對照之間存在較為明顯的差異，反義抑制的效率較高，抑制了CCR基因的表達。 4)改進了提取棉花不同時期纖維的RNA的熱硼酸法。棉花GhCCR4基因在本文所檢測的組織中均有所表

6、達，尤其在根，莖桿中表達量較大，說明此基因有組織表達特異性。在棉纖維不同發(fā)育時期的轉錄水平有很大變化，在纖維發(fā)育初期(0-10 DPA)表達微弱，在15，20 DPA表達量最大，在25 DPA表達量降低，說明此基因在棉纖維伸長發(fā)育后期高效表達。 5)對GhCCR4基因過量表達和RNA干擾轉基因棉花苗期形態(tài)觀察、木質素和纖維素含量檢測等方法進行比較和分析，發(fā)現他們與對照之間在植株形態(tài)上存在一定的差異，木質素含量降低，這可能的原因是