YABBY5和CRC基因在佛手果實發(fā)育中的功能初探.pdf

1、佛手（Citrus medica var.L.sarcodactylis Swingle）是蕓香科(Rutaceae)柑橘屬（Citrus spp.）植物，屬于香櫞（C medica L.）的變種。佛手本身果實奇特，與香櫞親緣關系很相近，但二者的果實形態(tài)有著極大差異。CRABS CLAW(CRC)和YABBY5基因都是YABBY基因家族成員，屬于植物中特有的一類轉錄因子，對于植物的生長發(fā)育及形態(tài)建成具有重要的生物學功能。
　　本研

2、究用形態(tài)學手段觀察佛手果形早期發(fā)育的歷程，并以金華青皮佛手和香櫞為材料，克隆分析CRC和YABBY5基因的序列結構，利用實時熒光定量PCR技術及病毒誘導的基因沉默(virus induced gene silencing，VIGS)技術分析兩個YABBY基因家族成員的表達和功能特性。
　　1.采集1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm佛手花芽、開花當天佛

3、手花及開花后佛手幼果。通過超景深顯微鏡和掃描電鏡觀察不同發(fā)育階段的佛手花芽形態(tài)，結果顯示，當芽體約1mm時進入花萼分花期，約2mm時進入雄蕊分化期(SD)，約3～4mm時進入雌蕊分化期(GD)。且早期花芽心皮原基就已出現(xiàn)了指狀突起，這些指狀凸起包含柱頭和花柱，但是隨著花的開放，柱頭早落，子房也出現(xiàn)了的指狀凸起。由此表明，佛手指狀部分由雌蕊子房發(fā)育而來，果形建成于開花前。
　　2.通過甜橙基因組數(shù)據(jù)分析設計相關引物，以香櫞為對照材料

4、，分別在佛手、香櫞中克隆了CRC基因啟動子序列和YABBY5基因gDNA和cDNA全長序列。在NCBI中比對佛手、香櫞CRC啟動子的基因序列，相似度為98％。通過PlantCARE軟件對CRC啟動子進行預測分析，發(fā)現(xiàn)兩段序列中均含有多種高等植物基因啟動子的保守功能元件，說明該序列具有啟動子活性。但與香櫞相比，佛手CRC啟動子缺失兩個TATA-Box元件，推測CRC啟動子在佛手中缺失序列可能引起CRC表達受影響。將佛手與香櫞YABBY5基

5、因序列與氨基酸序列進行比對。結果發(fā)現(xiàn)，佛手YABBY5基因cDNA序列與香櫞比對缺失21bp，其氨基酸序列與香櫞相比缺失7個氨基酸，且缺失序列出現(xiàn)在其保守區(qū)域(CDs)，因此認為YABBY5基因可能會影響佛手的果實發(fā)育。
　　3.分別在佛手雄蕊分化期(SD)、雌蕊分化期(GD)、開花前6天、開花當天、花后3天、花后6天及后9天等不同發(fā)育時期進行取樣，利用qRT-PCR技術對兩個基因的表達情況進行分析。對CRC和YABBY5在佛手、

6、香櫞花器官不同時期的表達量檢測顯示，CRC基因在佛手開花前后表達下調，且在花器官發(fā)育各時期的表達量均顯著低于香櫞;YABBY5基因在佛手開花前后表達上調，但在各時期的表達量也都顯著低于香櫞。前期研究表明，佛手經(jīng)高溫誘導后會產(chǎn)生近似香櫞的拳狀果形。將新梢停長的佛手分別置于20℃和5℃處理60天，再于25/18℃恒溫培養(yǎng)至花芽形態(tài)分化期進行取樣，檢測高低溫誘導后佛手花器官不同時期的表達量。結果顯示:在開花前3天、開花當天和開花后3天，高溫誘

7、導后CRC基因表達水平顯著高于低溫誘導的情況，且花后表達水平降低;高溫誘導后YABBY5基因在花后的表達水平均高于低溫誘導的表達水平，其中開花三天內差異最顯著。從表達趨勢分析，CRC、YABBY5基因在高溫誘導后佛手花器官的表達情況更接近香櫞，由此說明，以上兩個YABBY基因與佛手的果形建成相關。
　　4.以子葉出土后30天左右的番茄Micro-Tom進行試驗，利用VIGS技術沉默番茄SlYABBY5b基因cDNA片段。結果顯示:

8、沉默SlYABBY5基因的植株在處理30d后穩(wěn)定坐果，且果實上端拉長變尖近梨形或出現(xiàn)凸起，此表型一直持續(xù)到處理后60d，但果實的轉色并未受到影響。在陰性對照組與實驗組中各選取25個番茄果實，經(jīng)過Tomato Analyzer3.0軟件分析，SlYABBY5沉默30-60d左右的番茄果被拉長，且沉默組果實果尖夾角顯著小于對照組果實(P＜0.01)。果實高度在46-63mm的區(qū)間內，沉默果實數(shù)目大于對照組;果尖角度在80°-119°的范圍內

9、，沉默組果實數(shù)目是對照組的2倍。利用STRING網(wǎng)站及參考相關文獻對YABBY5互作基因進行預測分析，發(fā)現(xiàn)在擬南芥中，KAN、KAN2、ETT、WOX1、AT4G38840.1、SUN和OVATE七個基因可能與YABBY5互作。檢測YABBY5及其預測互做基因在對照組與沉默組果實中的表達水平。結果表明，SlYABBY5基因在沉默果實中表達量下降，其它基因的表達水平也出現(xiàn)變化?？梢?，YABBY5基因的下調會影響果實形狀，作為轉錄因子也能影