中藥活性成分在線色譜篩選新模型研究.pdf

1、中藥活性物質(zhì)是指中藥及其復(fù)方中發(fā)揮作用的化學(xué)成分，它是闡明中藥作用奧秘的關(guān)鍵。由于中藥作用的整體性、中藥成分和作用機(jī)制的復(fù)雜性，使得中藥效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)的闡明一直進(jìn)展緩慢。尋找適于中藥復(fù)雜體系效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)的研究方法，進(jìn)而建立科學(xué)的質(zhì)量控制方法，一直是中藥研究的關(guān)鍵科學(xué)問題。長期以來，國內(nèi)中藥活性物質(zhì)基礎(chǔ)研究的主流模式是在化學(xué)成分提取、分離和結(jié)構(gòu)鑒定的基礎(chǔ)上利用藥理模型對(duì)所得的純化合物進(jìn)行生物活性測(cè)試。多年來，這種研究方法闡明了一些中藥的效應(yīng)

2、物質(zhì)基礎(chǔ)。但是，常規(guī)的提取分離手段只能分析中藥的主要特征性成分，而不能評(píng)價(jià)這些成分是否具有活性。
　　 本論文的研究目的是構(gòu)建不同層次的中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的在線篩選色譜模型，并以各類提取物的抗氧化或細(xì)胞毒性指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，使效應(yīng)成分的分離與篩選相結(jié)合，克服以往先從中藥中分離單體或部位，再分析其藥效，致使成分分離與效應(yīng)篩選脫節(jié)的弊端。主要研究工作如下:
　　 1.構(gòu)建抗腫瘤藥物的脂筏色譜在線篩選模型并研究其熱力學(xué)機(jī)理

3、，將由U251細(xì)胞提取的脂筏固化于硅膠載體上制備酪氨酸蛋白激酶受體(TrkA)-脂筏色譜柱，進(jìn)行色譜保留特性研究。由于構(gòu)建的脂筏-硅膠固定相富含TrkA，固定相能與以TrkA為靶點(diǎn)的藥物特異性結(jié)合產(chǎn)生保留，而非TrkA靶點(diǎn)的藥物在該脂筏色譜柱中無保留行為。經(jīng)不同時(shí)間和不同流動(dòng)相的使用，證明TrkA-脂筏固定相色譜系統(tǒng)穩(wěn)定，使用壽命長。首次進(jìn)行脂筏色譜的機(jī)理研究，以TrkA為靶點(diǎn)的藥物來他替尼為例，考察了脂筏色譜柱填料粒徑、溫度、流速對(duì)色

4、譜行為的影響，探討了溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間的遷移焓變、遷移熵變等熱力學(xué)參數(shù)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)適宜的填料粒徑有利于來他替尼在脂筏色譜上的保留及分離;在柱溫37℃，流速0.2ml/min的色譜條件下能得到較適宜的保留效果。對(duì)于來他替尼而言，與脂筏固定相作用過程的△H0、△S0均為負(fù)值，說明這種脂筏固定相的分離機(jī)理是氫鍵或范德華力等協(xié)同作用的結(jié)果。
　　 2.將構(gòu)建的脂筏色譜系統(tǒng)應(yīng)用于中藥五倍子的抗腫瘤活性成分篩選，得到的在色譜柱上有

5、保留行為的乙醚部分顯示出良好的抑制U251腫瘤細(xì)胞毒性。為進(jìn)一步證明這種柱上保留行為是TrkA與藥物間結(jié)合力的結(jié)果，而非脂筏中其他蛋白的作用，我們?cè)诩?xì)胞試驗(yàn)的對(duì)照組中加入了低濃度的TrkA信號(hào)阻斷劑，觀察在TrkA脂筏柱上有保留的物質(zhì)在細(xì)胞試驗(yàn)中飽和TrkA后，是否還能繼續(xù)抑制U251細(xì)胞的增值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，脂筏色譜篩選出的具有明顯保留行為的中藥提取物與特異性TrkA抑制劑來他替尼一樣，在TrkA信號(hào)阻斷前體現(xiàn)出良好的抑制細(xì)胞增值的效

6、果，信號(hào)阻斷后則幾乎無細(xì)胞抑制作用。而氟尿嘧啶并非以TrkA作為靶點(diǎn)，所以在TrkA信號(hào)阻斷前后均體現(xiàn)出良好的腫瘤細(xì)胞抑制效果，證明脂筏色譜是一種針對(duì)TrkA的高選擇性、高特異性的生物親和色譜新技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)為TrkA抑制劑的高效篩選提供了范例，證實(shí)了脂筏色譜在中藥活性成分高效篩選中的應(yīng)用可能。說明富含TrkA受體的脂筏-硅膠色譜是一種具有生物親和特性、能夠選擇性識(shí)別與TrkA受體作用的藥物的新型先導(dǎo)化合物篩選模型。
　　 3.1

7、，1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH·)-檢測(cè)器后衍生化高效液相色譜(HPLC)法在線篩選抗氧化活性成分技術(shù)的構(gòu)建及在水飛薊素及其脫氫衍生物中的應(yīng)用。首次合成水飛薊素的脫氫衍生物，超高效液相色譜(UPLC)-質(zhì)譜(MS)聯(lián)用鑒別水飛薊素脫氫化物的組成;對(duì)水飛薊素及其脫氫衍生物進(jìn)行DPPH·清除能力、還原力、超氧自由基清除能力、Fe3+還原實(shí)驗(yàn)、羥基自由基清除能力等體外抗氧化能力的評(píng)價(jià);同時(shí)研制DPPH-檢測(cè)器后衍生化HPLC技術(shù)進(jìn)行

8、抗氧化活性成分的快速在線篩選，并通過動(dòng)物體內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)外抗氧化能力的評(píng)價(jià)試驗(yàn)中，幾乎所有脫氫化物的抗氧化活性指標(biāo)均明顯大于脫氫前的藥物，表明水飛薊素的脫氫化衍生物具有更強(qiáng)的抗氧化活性。DPPH-HPLC法在線篩選出脫氫水飛薊素的主要抗氧化活性成分為2，3-去氫水飛薊賓和2，3-去氫水飛薊亭。說明所構(gòu)建的中藥抗氧化藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的活性篩選-化學(xué)在線分析方法具有切實(shí)的可行性。
　　 4.DPPH-薄層色譜(TL

9、C)生物自顯影法在線篩選抗氧化活性成分技術(shù)的構(gòu)建及其在綿茵陳中的應(yīng)用。采用HPLC及TLC法測(cè)定綿茵陳提取物中綠原酸的含量，紫外法離線測(cè)定提取液清除DPPH·的能力。另建立DPPH-TLC生物自顯影法在線分析綿茵陳提取物中的抗氧化成分。結(jié)果表明，由生物自顯影掃描法測(cè)得薄層色譜的色譜峰總積分值明顯大于綠原酸單峰面積，表明綿茵陳中除了綠原酸外，還存在其它抗氧化能力較強(qiáng)的活性成分。說明以DPPH·作顯色劑，雙波長掃描，可利用TLC-生物自顯影