中藥活性成分在線色譜篩選新模型研究.pdf

1、中藥活性物質(zhì)是指中藥及其復(fù)方中發(fā)揮作用的化學(xué)成分，它是闡明中藥作用奧秘的關(guān)鍵。由于中藥作用的整體性、中藥成分和作用機制的復(fù)雜性，使得中藥效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)的闡明一直進展緩慢。尋找適于中藥復(fù)雜體系效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)的研究方法，進而建立科學(xué)的質(zhì)量控制方法，一直是中藥研究的關(guān)鍵科學(xué)問題。長期以來，國內(nèi)中藥活性物質(zhì)基礎(chǔ)研究的主流模式是在化學(xué)成分提取、分離和結(jié)構(gòu)鑒定的基礎(chǔ)上利用藥理模型對所得的純化合物進行生物活性測試。多年來，這種研究方法闡明了一些中藥的效應(yīng)

2、物質(zhì)基礎(chǔ)。但是，常規(guī)的提取分離手段只能分析中藥的主要特征性成分，而不能評價這些成分是否具有活性。
　　 本論文的研究目的是構(gòu)建不同層次的中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的在線篩選色譜模型，并以各類提取物的抗氧化或細胞毒性指標(biāo)的測定結(jié)果進行驗證，使效應(yīng)成分的分離與篩選相結(jié)合，克服以往先從中藥中分離單體或部位，再分析其藥效，致使成分分離與效應(yīng)篩選脫節(jié)的弊端。主要研究工作如下:
　　 1.構(gòu)建抗腫瘤藥物的脂筏色譜在線篩選模型并研究其熱力學(xué)機理

3、，將由U251細胞提取的脂筏固化于硅膠載體上制備酪氨酸蛋白激酶受體(TrkA)-脂筏色譜柱，進行色譜保留特性研究。由于構(gòu)建的脂筏-硅膠固定相富含TrkA，固定相能與以TrkA為靶點的藥物特異性結(jié)合產(chǎn)生保留，而非TrkA靶點的藥物在該脂筏色譜柱中無保留行為。經(jīng)不同時間和不同流動相的使用，證明TrkA-脂筏固定相色譜系統(tǒng)穩(wěn)定，使用壽命長。首次進行脂筏色譜的機理研究，以TrkA為靶點的藥物來他替尼為例，考察了脂筏色譜柱填料粒徑、溫度、流速對色

4、譜行為的影響，探討了溶質(zhì)在固定相和流動相之間的遷移焓變、遷移熵變等熱力學(xué)參數(shù)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)適宜的填料粒徑有利于來他替尼在脂筏色譜上的保留及分離;在柱溫37℃，流速0.2ml/min的色譜條件下能得到較適宜的保留效果。對于來他替尼而言，與脂筏固定相作用過程的△H0、△S0均為負值，說明這種脂筏固定相的分離機理是氫鍵或范德華力等協(xié)同作用的結(jié)果。
　　 2.將構(gòu)建的脂筏色譜系統(tǒng)應(yīng)用于中藥五倍子的抗腫瘤活性成分篩選，得到的在色譜柱上有

5、保留行為的乙醚部分顯示出良好的抑制U251腫瘤細胞毒性。為進一步證明這種柱上保留行為是TrkA與藥物間結(jié)合力的結(jié)果，而非脂筏中其他蛋白的作用，我們在細胞試驗的對照組中加入了低濃度的TrkA信號阻斷劑，觀察在TrkA脂筏柱上有保留的物質(zhì)在細胞試驗中飽和TrkA后，是否還能繼續(xù)抑制U251細胞的增值。實驗結(jié)果可見，脂筏色譜篩選出的具有明顯保留行為的中藥提取物與特異性TrkA抑制劑來他替尼一樣，在TrkA信號阻斷前體現(xiàn)出良好的抑制細胞增值的效

6、果，信號阻斷后則幾乎無細胞抑制作用。而氟尿嘧啶并非以TrkA作為靶點，所以在TrkA信號阻斷前后均體現(xiàn)出良好的腫瘤細胞抑制效果，證明脂筏色譜是一種針對TrkA的高選擇性、高特異性的生物親和色譜新技術(shù)。本實驗為TrkA抑制劑的高效篩選提供了范例，證實了脂筏色譜在中藥活性成分高效篩選中的應(yīng)用可能。說明富含TrkA受體的脂筏-硅膠色譜是一種具有生物親和特性、能夠選擇性識別與TrkA受體作用的藥物的新型先導(dǎo)化合物篩選模型。
　　 3.1

7、，1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH·)-檢測器后衍生化高效液相色譜(HPLC)法在線篩選抗氧化活性成分技術(shù)的構(gòu)建及在水飛薊素及其脫氫衍生物中的應(yīng)用。首次合成水飛薊素的脫氫衍生物，超高效液相色譜(UPLC)-質(zhì)譜(MS)聯(lián)用鑒別水飛薊素脫氫化物的組成;對水飛薊素及其脫氫衍生物進行DPPH·清除能力、還原力、超氧自由基清除能力、Fe3+還原實驗、羥基自由基清除能力等體外抗氧化能力的評價;同時研制DPPH-檢測器后衍生化HPLC技術(shù)進行

8、抗氧化活性成分的快速在線篩選，并通過動物體內(nèi)抗氧化實驗進行驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)外抗氧化能力的評價試驗中，幾乎所有脫氫化物的抗氧化活性指標(biāo)均明顯大于脫氫前的藥物，表明水飛薊素的脫氫化衍生物具有更強的抗氧化活性。DPPH-HPLC法在線篩選出脫氫水飛薊素的主要抗氧化活性成分為2，3-去氫水飛薊賓和2，3-去氫水飛薊亭。說明所構(gòu)建的中藥抗氧化藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的活性篩選-化學(xué)在線分析方法具有切實的可行性。
　　 4.DPPH-薄層色譜(TL

9、C)生物自顯影法在線篩選抗氧化活性成分技術(shù)的構(gòu)建及其在綿茵陳中的應(yīng)用。采用HPLC及TLC法測定綿茵陳提取物中綠原酸的含量，紫外法離線測定提取液清除DPPH·的能力。另建立DPPH-TLC生物自顯影法在線分析綿茵陳提取物中的抗氧化成分。結(jié)果表明，由生物自顯影掃描法測得薄層色譜的色譜峰總積分值明顯大于綠原酸單峰面積，表明綿茵陳中除了綠原酸外，還存在其它抗氧化能力較強的活性成分。說明以DPPH·作顯色劑，雙波長掃描，可利用TLC-生物自顯影