芹菜素通過調(diào)節(jié)transgelin蛋白抑制結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移.pdf

1、背景:
　　 結(jié)直腸癌(colorectalcancer，CRC)一直是很受關(guān)注的健康問題，在世界范圍內(nèi)每年發(fā)病超過100萬(wàn)，是引起死亡的第二大原因。結(jié)直腸癌的發(fā)病原因及機(jī)制至今尚未闡明。CRC的發(fā)生是由遺傳因素及生活方式相關(guān)因素決定的。結(jié)直腸癌早期以外科手術(shù)治療為首選。然而，診斷為CRC的病人大約40％將來(lái)會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移，在此時(shí)，輔助治療和姑息治療尤為顯得重要，無(wú)論是在提高療效、延長(zhǎng)壽命還是改善生活質(zhì)量方面都發(fā)揮著重要作用。然而，

2、現(xiàn)有的化療藥品種少，有效、低毒、價(jià)廉的更少，分子靶向藥物雖為結(jié)直腸癌治療提供了新的途徑，但其應(yīng)用及效果也不是很確切，且價(jià)格昂貴。隨著患者對(duì)現(xiàn)有化療藥產(chǎn)生耐藥后，治療效果也明顯下降，在這種種現(xiàn)實(shí)情況下，對(duì)新的低毒、高效、價(jià)廉的藥物的研究是十分必要的。
　　 黃酮類化合物廣泛存在于水果、蔬菜、茶等植物源性食物中，許多中藥發(fā)揮作用的主要成分也是黃酮。黃酮類化合物由于結(jié)構(gòu)特征不同，而表現(xiàn)出不同的生物活性，包括細(xì)胞生物信號(hào)活化、抗炎癥反應(yīng)

3、、抗血管生成、抗氧化、抗炎、抗腫瘤作用。已被證實(shí)具有抗多種腫瘤侵襲和/或轉(zhuǎn)移的活性，包括腦，口腔，咽，甲狀腺，乳腺，肺，肝臟，膽管，胰腺，睪丸，小腸，結(jié)腸，腎，卵巢，宮頸，前列腺，和表皮等癌癥;還包括纖維肉瘤，骨肉瘤，卡波西氏肉瘤，和黑色素瘤等。
　　 芹菜素(apigenin，API)是一種天然的黃酮類化合物，與其他的黃酮類化合物相比，其因毒性更低，療效更顯著，作為一種腫瘤化學(xué)預(yù)防用藥受到廣泛的關(guān)注。芹菜素具有多種生物學(xué)活性和

4、藥理作用，在體外以及體內(nèi)眾多的哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中的芹菜素的生物效應(yīng)與其抗氧化作用及其清除作用自由基有關(guān)。此外，它還具有抗突變、抗炎、抗病毒、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、放化療增敏等作用。近年研究表明，芹菜素抗腫瘤的主要作用機(jī)制是抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移及干擾腫瘤細(xì)胞的信號(hào)途徑等。芹菜素可以抑制如前列腺癌、卵巢癌、膀胱癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，其抗腫瘤作用表現(xiàn)出多樣性。
　　 然而，芹菜素對(duì)結(jié)直

5、腸癌作用的研究較少，尤其是其抗結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移及機(jī)制研究缺乏。本研究通過觀察芹菜素對(duì)整體可視化裸鼠原位結(jié)直腸癌模型的作用及人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的生物學(xué)行為包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及侵襲能力的影響，闡明其在結(jié)直腸癌中發(fā)揮的作用，同時(shí)通過雙向電泳技術(shù)篩選差異蛋白，飛行質(zhì)譜技術(shù)鑒定差異蛋白鑒定出transgelin(TAGLN，SM22)蛋白。Transgelin是一個(gè)分子量為22kDa-25kDa的細(xì)胞骨架蛋白，研究發(fā)現(xiàn)其與

6、腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化或癌變的進(jìn)展密切聯(lián)系。另外研究發(fā)現(xiàn)transgelin是一種新型的MMP-9表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，Transgelin通過一個(gè)氨基酸總站調(diào)寧蛋白同源結(jié)構(gòu)域經(jīng)由ERK激活受損的方式降低AP-1依賴的反式活化從而抑制MMP-9表達(dá)。研究推測(cè)癌癥時(shí)transgelin的表達(dá)降低可能是在這些腫瘤MMP-9表達(dá)提高明顯的部分原因。故而在以上背景下，本研究進(jìn)一步探索芹菜素是否通過調(diào)節(jié)transgelin、MMP-9表達(dá)而達(dá)到抗腫瘤的目的

7、，為芹菜素抗腫瘤尋找分子機(jī)制理論依據(jù)。
　　 目的:
　　 本研究旨在研究黃酮類天然藥物芹菜素對(duì)結(jié)直腸癌的作用，并且探索芹菜素發(fā)生這些效應(yīng)的分子機(jī)制，為芹菜素抗腫瘤尋找分子生物學(xué)層面理論依據(jù)。為芹菜素應(yīng)用于臨床提供更可靠依據(jù)，且可能為治療結(jié)直腸癌提供新的作用靶點(diǎn)。
　　 方法:
　　 芹菜素作用于可視化結(jié)直腸癌裸鼠模型的研究
　　 根據(jù)文獻(xiàn)方法建立可視化裸鼠原位結(jié)直腸癌動(dòng)物模型，芹菜素按100mg

8、/kg/d灌胃，于瘤體可于成像系統(tǒng)觀察到開始給藥，接種42天后將成像觀察到原位實(shí)體瘤12只裸鼠隨機(jī)分為兩組，每組6只，一組芹菜素干預(yù)組，一組溶劑對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)前記錄裸鼠體重及應(yīng)用活體成像系統(tǒng)觀察瘤體。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)態(tài)測(cè)量裸鼠體重、動(dòng)態(tài)觀察腫瘤體積改變、腫瘤轉(zhuǎn)移情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后裸鼠原位種植實(shí)體瘤重量測(cè)量，腫瘤轉(zhuǎn)移情況觀察。
　　 MTT法檢測(cè)對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響
　　 常規(guī)培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞，處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)時(shí)分

9、成5組:即20，40，80，120μM芹菜素組及溶劑對(duì)照組。每個(gè)劑量組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，加藥后分別培養(yǎng)24和48h。MTT法檢測(cè)對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響。根據(jù)下列公式計(jì)算芹菜素對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制率:抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)藥物組OD值/空白對(duì)照組OD值)×100％。
　　 劃痕損傷試驗(yàn)
　　 實(shí)驗(yàn)分為兩組，一組為芹菜素組(40μM)，一組為溶劑對(duì)照組，觀察干預(yù)24h及48h后SW480細(xì)胞劃痕修復(fù)能力即細(xì)胞遷移能力。
　　

10、 Transwell小室侵襲試驗(yàn)
　　 實(shí)驗(yàn)分為兩組，一組為芹菜素組（40μM），一組為溶劑對(duì)照組，干預(yù)24h及48h后，通過Transwell小室侵襲試驗(yàn)觀察兩組細(xì)胞侵襲能力。
　　 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期
　　 實(shí)驗(yàn)時(shí)分成5組:即20，40，80，120μM芹菜素組及溶劑對(duì)照組，培養(yǎng)24或48h結(jié)束后PI溶液染色，調(diào)細(xì)胞數(shù)為（1-5）×105/mL，流式細(xì)胞儀檢測(cè)檢測(cè)細(xì)胞周期各時(shí)相的變化，細(xì)胞周期結(jié)果分析以M

11、odifit2.0軟件分析。
　　 Hoechst33258染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡
　　 SW480細(xì)胞以2×105/孔的密度按以上實(shí)驗(yàn)分組于6孔板中培養(yǎng)，干預(yù)48h后，Hoechst33258染色液染色檢測(cè)各組凋亡情況。
　　 AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)
　　 SW480細(xì)胞以2×105/孔的密度按以上實(shí)驗(yàn)分組于6孔板中培養(yǎng)，干預(yù)48h后，AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒染色。于熒光顯

12、微鏡下雙色濾光片觀察。AnnexinV-FITC熒光信號(hào)為綠色，PI信號(hào)為呈紅色。
　　 雙向電泳技術(shù)篩選飛行質(zhì)譜技術(shù)鑒定差異蛋白
　　 實(shí)驗(yàn)分為芹菜素組（40μM）和溶劑對(duì)照組，干預(yù)48h后，抽提線粒體蛋白，通過雙向電泳技術(shù)篩選兩組表達(dá)差異的蛋白，飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)鑒定差異蛋白。
　　 細(xì)胞免疫熒光技術(shù)驗(yàn)證差異蛋白的表達(dá)
　　 實(shí)驗(yàn)分為芹菜素組(40μM)和溶劑對(duì)照組，干預(yù)12h或24h，通過免疫熒光雙染

13、觀察差異蛋白在線粒體的表達(dá)及在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及易位情況。
　　 qPCR技術(shù)檢測(cè)芹菜素干預(yù)后差異蛋白mRNA的表達(dá)情況
　　 實(shí)驗(yàn)時(shí)分成5組:即20，40，80，120μM芹菜素組及溶劑對(duì)照組，干預(yù)24h。通過qPCR技術(shù)檢測(cè)芹菜素干預(yù)后差異蛋白mRNA的表達(dá)情況。
　　 Westernblot技術(shù)檢測(cè)芹菜素干預(yù)后差異蛋白的表達(dá)情況
　　 1)實(shí)驗(yàn)分為芹菜素組(40μM)和溶劑對(duì)照組，干預(yù)48h，抽提線粒體

14、蛋白、胞漿蛋白、核蛋白，觀察差異蛋白在線粒體、細(xì)胞漿及細(xì)胞核中的表達(dá)情況。
　　 2)實(shí)驗(yàn)時(shí)分成5組:即20，40，80，120μM芹菜素組及溶劑對(duì)照組，干預(yù)48h。抽提總蛋白，驗(yàn)證芹菜素干預(yù)對(duì)差異蛋白表達(dá)的影響。
　　 RNAi技術(shù)觀察干擾差異蛋白基因表達(dá)后SW480細(xì)胞的生長(zhǎng)情況
　　 將差異蛋白基因siRNA通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到SW480細(xì)胞，觀察瞬時(shí)轉(zhuǎn)染siRNA對(duì)SW480細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
　　 組

15、織芯片免疫組化技術(shù)觀察不同組織類型差異蛋白表達(dá)情況
　　 通過免疫組化技術(shù)觀察人大腸腺癌組織(n=30)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病灶(n=25)及肝臟轉(zhuǎn)移病灶(n=5)差異蛋白的表達(dá)情況。
　　 統(tǒng)計(jì)分析
　　 所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示;各組間比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析;多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，方差不齊的采用Tamhane'

16、sT2法;兩組比較根據(jù)是否服從正態(tài)分布而選擇用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗(yàn);顯著性標(biāo)準(zhǔn)為α=0.05，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與模型組比較，芹菜素具有抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)的作用;芹菜素處理后裸鼠瘤體相對(duì)熒光強(qiáng)度減弱，經(jīng)兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，統(tǒng)計(jì)量t值分別為-14.958，P值小于0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，芹菜

17、素可以抑制裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)。兩組大腸均可見不同程度的綠色熒光，表明兩組大腸均有不同程度的腫瘤生長(zhǎng)，經(jīng)IPP6.0軟件對(duì)各組織熒光進(jìn)行半定量分析，再對(duì)熒光強(qiáng)度值進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)量t值為-4.630，P值為0.000，兩組裸鼠大腸腫瘤生長(zhǎng)情況差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。芹菜素組裸鼠僅1只出現(xiàn)明顯肝臟轉(zhuǎn)移病灶，腫瘤生長(zhǎng)能力較弱，模型組6只均有不同程度的肝臟轉(zhuǎn)移病灶，腫瘤生長(zhǎng)能力較強(qiáng)，通過IPP6.0軟件對(duì)各組織熒光進(jìn)行半定量分析，再對(duì)熒光強(qiáng)度值進(jìn)

18、行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)量t值為-4.917，P值0.000，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果表明芹菜素具有降低結(jié)直腸癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的肝轉(zhuǎn)移能力的作用。
　　 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 MTT結(jié)果顯示:不同濃度芹菜素作用于人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞24及48h后細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率應(yīng)用One-WayANOVA方差分析得出，不同濃度芹菜素干預(yù)24h或48h后SW480細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)值分別為318.645、156.662，P值均小

19、于0.001，從藥物從濃度因素看，應(yīng)用LSD法進(jìn)行多重比較顯示，40μM和80μM濃度組之間無(wú)顯著性差異，P＞0.05，余濃度組之間具有顯著性差異，P＜0.05;從藥物作用時(shí)間因素看，應(yīng)用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)顯示，不同作用時(shí)間兩兩比較DMSO組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＞0.05，其他組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。芹菜素可以抑制結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞的生長(zhǎng)，在高于80μM的濃度后出現(xiàn)抑制作用平臺(tái)期。
　　 劃痕損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:40

20、μM芹菜素作用24h及48h均能降低SW480細(xì)胞的遷移能力，與溶劑對(duì)照組的細(xì)胞遷移率相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為6.469，12.751，P值均小于0.001)。
　　 Transwell小室基質(zhì)侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:用40μM芹菜素處理SW480細(xì)胞24及48h后，腫瘤細(xì)胞的體外侵襲能力明顯下降。24h芹菜素組與溶劑對(duì)照組的侵襲細(xì)胞數(shù)分別為13.11±3.26和67.78±14.21，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.

21、249，P＜0.001)。48h芹菜素組與溶劑對(duì)照組的侵襲細(xì)胞數(shù)分別為91.38±12.98和228.50±78.76，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-4.859，P=0.002)。
　　 33258染色顯示:不同濃度芹菜素處理SW480細(xì)胞凋亡率應(yīng)用重復(fù)測(cè)量方差分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.027，P=0.147)，提示芹菜素?zé)o促進(jìn)SW480細(xì)胞凋亡的作用。
　　 AnnexinV-FITC染色顯示:兩組凋亡細(xì)胞所占

22、總細(xì)胞數(shù)比值相似，故芹菜素引起SW480細(xì)胞凋亡與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.044，P=0.198)。
　　 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示:經(jīng)不同處理后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，應(yīng)用重復(fù)測(cè)量方差分析得出，SW480細(xì)胞經(jīng)不同濃度芹菜素處理不同時(shí)間后，與對(duì)照組相比，不同濃度組間48hG0/G1、S、G2/M期細(xì)胞分布有顯著性差異(F值分別為28.781,4.972，46.475，P值均小于0.05)，24hG0/G1、S、G2/M期

23、細(xì)胞分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F值分別為1.403，1.013，1.886，P值均大于0.05）。芹菜素作用48h抑制SW480細(xì)胞周期，使其停滯在G2/M期。
　　 雙向電泳篩選出12個(gè)蛋白，經(jīng)飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定出9個(gè)，我們選擇transgelin蛋白作進(jìn)一步研究。
　　 免疫熒光結(jié)果顯示:transgelin蛋白在細(xì)胞漿、細(xì)胞核、線粒體均有表達(dá)，且在細(xì)胞核中的表達(dá)最高，在12h及24h均未出現(xiàn)明顯易位情況，提示芹菜素作用

24、后線粒體蛋白的增加并不是通過蛋白的易位引起。
　　 QPCR檢測(cè)結(jié)果顯示:不同濃度芹菜素處理SW480細(xì)胞24htransgelin的總mRNA的表達(dá)有差異，芹菜素上調(diào)transgelin的mRNA的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=498.798，P＜0.001。)
　　 Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示:
　　 1)transgelin蛋白的表達(dá)在細(xì)胞漿、細(xì)胞核及線粒體中均有表達(dá)，且以細(xì)胞核中表達(dá)最多，與免疫熒光

25、結(jié)果一致。
　　 2)芹菜素處理48h后上調(diào)SW480細(xì)胞transgelin蛋白的表達(dá)，與未加芹菜素處理相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=13.312，P=0.001）。隨著芹菜素濃度的增加，transgelin蛋白上調(diào)越明顯，20μM芹菜素組與空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而40、80、120μM芹菜素組與空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.042，0.007，0.000)

26、，與前述雙向電泳蛋白篩選飛行質(zhì)譜鑒定結(jié)果相一致。芹菜素處理48h后SW480細(xì)胞MMP-9蛋白的表達(dá)下調(diào)，與未加芹菜素處理相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=20.396，P＜0.001）。以80μM芹菜素組下調(diào)最明顯。
　　 RNAi結(jié)果顯示:transgelin-siRNA干擾SW480細(xì)胞48h后，SW480細(xì)胞的生長(zhǎng)加快，與陰性對(duì)照組和LIPO對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=134.583，P=0.000)。siRNA433組

27、細(xì)胞的生長(zhǎng)最快，是NC組的1.35倍。
　　 組織芯片免疫組化結(jié)果顯示:人結(jié)腸癌腺癌組織transgelin蛋白的表達(dá)比轉(zhuǎn)移病灶組織高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-2.075，P=0.038）。表明transgelin蛋白表達(dá)低的結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)。
　　 結(jié)論:
　　 1)芹菜素具有抑制結(jié)直腸癌生長(zhǎng)及肝轉(zhuǎn)移作用，其與芹菜素抑制SW480細(xì)胞的生長(zhǎng)及侵襲相關(guān)，其作用機(jī)制可能與芹菜素提高transgelin的表達(dá)、降