MiR-196a通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)人結(jié)直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移.pdf

1、背景：
　　越來越多的證據(jù)表明,microRNA(miRNA)在腫瘤轉(zhuǎn)移中通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程發(fā)揮了關(guān)鍵作用。我們通過qRT-PCR檢測時發(fā)現(xiàn)miR-196a在人類結(jié)直腸癌(CRC)細(xì)胞和結(jié)直腸癌組織中呈高表達(dá)。wound healing和cell migration assays實驗表明miR-196a促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移,而miR-196a-in呈現(xiàn)相反的效果。與EMT相關(guān)的E-鈣粘蛋白(E-cadherin)

2、、α-鈣粘蛋白(α-catenin)和波形蛋白(vimentin)采用qRT-PCR和 Western-Blots分析發(fā)現(xiàn)miR-196a上調(diào)波形蛋白的表達(dá)并下調(diào)E-cadherin和α-catenin表達(dá)?？傊?miR-196a通過調(diào)節(jié)EMT促進(jìn)了結(jié)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
　　研究目的：
　　通過利用qRT-PCR方法來檢測結(jié)直腸癌細(xì)胞株、結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中miR-196a的表達(dá)情況,選擇適當(dāng)?shù)慕Y(jié)直腸癌細(xì)胞株進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

3、并設(shè)置對照實驗組,進(jìn)一步通過qRT-PCR、woundhealing、cell migration方法證實miR-196a在結(jié)直腸癌細(xì)胞中呈高表達(dá)并能促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。利用qRT-PCR和Western-blots實驗分別觀察EMT相關(guān)的E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、α-粘蛋白(α-catenin)和波形蛋白(vimentin)表達(dá)情況,分析miR-196a是否調(diào)節(jié)了EMT過程。
　　研究方法：
　　1.通過qR

4、T-PCR技術(shù)檢測八對結(jié)直腸癌及癌旁組織，以及3種結(jié)直腸癌細(xì)胞株（HT-29、SW620、SW480）的miR-196a表達(dá)情況,根據(jù)檢測結(jié)果選擇相應(yīng)結(jié)直腸癌細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。
　　2.將已經(jīng)選擇的結(jié)直腸癌細(xì)胞株進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染(miR-196a-in、miR-196a)及相應(yīng)的陰性對照組(NC)和(NC-in),共計4組并繼續(xù)培養(yǎng)。
　　3.Wound healing細(xì)胞劃痕實驗,觀察4組細(xì)胞遷移移動距離,在顯微鏡下進(jìn)行拍攝

5、,利用Pro Plus6圖像軟件進(jìn)行分析。
　　4.Migration assays遷移分析,采用Transwell膜進(jìn)行遷移實驗,觀察染色細(xì)胞在顯微鏡下活動并計數(shù)。
　　5.Western-blots免疫印跡實驗,用β-actin(β肌動蛋白)作為內(nèi)參檢測E-cadherin、vimentin及α-catenin情況并進(jìn)行分析。
　　統(tǒng)計分析
　　所有統(tǒng)計的數(shù)據(jù)均以平均±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示,利用SPSS17軟件

6、進(jìn)行統(tǒng)計處理。P值小于0.05被認(rèn)為有顯著差異。
　　研究結(jié)果：
　　1.我們采用了qRT-PCR技術(shù)對8組結(jié)直腸癌組織(T)及癌旁組織(ANT)中的miR-196a表達(dá)量進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)：結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中miR-196a表達(dá)差異性明(P＜0.05),T/ANT大于1。檢測結(jié)直腸癌細(xì)胞系中(HT-29、SW620和 SW480)通過qRT-PCR分析,結(jié)果表明：SW620結(jié)直腸癌細(xì)胞株中miR-196a表達(dá)量與HT-29

7、細(xì)胞株接近,明顯高于SW480細(xì)胞株,而且相比之下SW620細(xì)胞株容易獲的,鑒于上述結(jié)果,就決定用SW620繼續(xù)行細(xì)胞實驗。
　　2.MiR-196a能促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移,將結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-196a和miR-196a-in并與(NC)和(NC-in)組進(jìn)行對照。Wound healing實驗證明SW620細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-196a后遷移距離最遠(yuǎn),與對照組相比差異性明顯(P＜0.05),與此相反的是SW620細(xì)胞株

8、轉(zhuǎn)染miR-196a-in后遷移距離最短,與對照組相比差異性明顯(P＜0.05)。此外,Migration assays實驗結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-196a后SW620細(xì)胞遷移能力明顯提高,而miR-196a-in降低了細(xì)胞的遷移距離,在統(tǒng)計學(xué)上差異性明顯(P＜0.05)。總之,這些實驗結(jié)果表明：miR-196a過度表達(dá)會促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
　　3.MiR-196a上調(diào)vimentin的表達(dá)并且下調(diào)E-cadherin和α-c

9、arenin表達(dá),我們確定了其機制的基礎(chǔ)為miR-196a通過調(diào)控EMT的相關(guān)的E-cadherin、vimentin和α-catenin實現(xiàn)的。RT-PCR顯示:miR-196a作用下vimentin中相應(yīng)的MRNA表達(dá)最高,E-cadherin和α-carenin明顯減少(P＜0.05),Western blot結(jié)果顯示,miR-196a在減少E-cadherin和α-carenin表達(dá)同時而增加vimentin表達(dá),miR-196