2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、納米技術在共遞送化療藥物和基因治療惡性腫瘤中顯示良好的應用前景,改善了藥物遞送過程中穩(wěn)定性低、溶解度小、選擇性差等問題。然而有效推動共遞送基因和化療藥物納米載體走向臨床仍需不斷努力。pH敏感共遞送藥物和基因納米載體以其可控釋藥的優(yōu)勢成為近年研究熱點。pH敏感共遞送抗癌藥和基因納米載體可簡單利用腫瘤微環(huán)境和內吞體/溶酶體酸性環(huán)境實現藥物和基因可控遞送,從而降低毒副作用并提高治療效果。腫瘤微環(huán)境pH敏感共遞送化療藥物和基因納米載體在血液循環(huán)

2、中穩(wěn)定存在,到達酸性腫瘤組織后,外殼pH敏感性脫落,暴露功能化內核并被腫瘤細胞攝取,增加胞內有效藥物濃度,提高抗腫瘤效果;內吞體/溶酶體pH敏感納米載體進入細胞內吞體/溶酶體后,在酸性pH誘導下可迅速釋放藥物,到達胞內可控釋藥目的。然而,隨著研究不斷深入,更為精確控制藥物釋放以及增加胞內有效藥物濃度問題受到廣泛關注。利用腫瘤微環(huán)境pH(6.0~7.0)低于正常組織pH(7.4),內吞體/溶酶體pH(4.5~6.5)低于胞漿pH(7.4)

3、,設計一種在腫瘤微環(huán)境和溶酶體/內吞體酸性環(huán)境中程序性響應地雙pH敏感共遞送藥物和基因納米載體可實現藥物和基因更為精確控制釋放并增加胞內有效藥物濃度。
  本課題采用功能集成組裝技術構建腫瘤微環(huán)境和內吞體/溶酶體雙pH敏感共遞送DOX和基因納米載體,以期實現化療藥物和基因更為可控地遞送。選取目前最為有效的聚陽離子基因載體聚乙烯亞胺(polyethyleneimine,PEI)作為內核材料共遞送化療藥物DOX和基因。采用內吞體/溶酶

4、體pH響應性裂解腙鍵連接DOX和PEI,合成了胞內pH敏感載藥材料DOX-PEI(DP)。O-羧甲基殼聚糖(O-carboxymethyl-chitosan,CMCS)生物相容性良好,且CMCS在pH高于7.0時荷負電而在pH低于6.5時荷正電?;诖?,合成了以NGR為靶向因子的腫瘤微環(huán)境pH敏感材料CMCS-PEG-NGR(CPN)?;谝陨瞎δ芑疍P和CPN,可組裝腫瘤微環(huán)境和內吞體/溶酶體雙pH敏感共遞送DOX和基因納米載體CPN

5、/DP/pDNA(CPN/DPD,CDPD)。DP作為一種陽離子聚合物,可有效壓縮荷負電的pDNA分子形成DP/pDNA復合物(DPD),實現藥物和基因的共同裝載。制備的內吞體/溶酶體pH敏感共遞送DOX和pDNA納米載藥DPD,DPD內核表面帶正電荷,在生理條件下(pH7.4)吸附荷負電CPN,形成腫瘤微環(huán)境和內吞體/溶酶體雙pH敏感共遞送DOX和基因納米載體CPN/DPD(CDPD)。CDPD經給藥后將在血液循環(huán)中穩(wěn)定存在,到達腫瘤

6、部位后,NGR介導轉胞吞作用在腫瘤組織蓄積。腫瘤微環(huán)境pH誘導CPN由負電荷逆轉為正電荷并從CDPD表面脫落(第一重pH敏感),暴露DPD內核。DPD表面正電荷可有效促進細胞攝取作用,進入腫瘤細胞的DPD輸送到內吞體/溶酶體,經內吞體/溶酶體酸性pH誘導,腙鍵斷裂并迅速釋放DOX(第二重pH敏感),由于PEI“質子海綿”效應產生溶酶體逃逸作用,PEI/pDNA和DOX釋放進入胞漿,并發(fā)揮相應抗腫瘤作用。實驗中以編碼綠色熒光蛋白的pDNA

7、為模型基因,考察CDPD在模擬腫瘤微環(huán)境pH和內吞體/溶酶體pH條件下CPN響應性脫落以及DOX和pDNA程序釋放。探究CDPD作為腫瘤微環(huán)境和內吞體/溶酶體雙pH敏感共遞送DOX和基因納米載體可能性,為進一步抗腫瘤研究奠定基礎。
  為進一步探究腫瘤微環(huán)境和內吞體/溶酶體雙pH敏感共遞送DOX和基因納米載體優(yōu)勢并提高胞內有效藥物和基因濃度,提高癌癥治療效果。利用TAT肽作為一種經典陽離子細胞穿透肽,以PEG共同連接TAT和PEI

8、,合成了具有促進穿細胞膜作用材料PEI-PEG-TAT(PPT)。同時選定腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體質粒(plasmid tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligands,pTRAIL)為治療基因。采用DP和PPT摻和壓縮制備胞內pH敏感的促細胞攝取PPT/DP/pTRAIL(PDT),制備的PDT內核包裹CPN后形成腫瘤組織和腫瘤細胞雙促進的腫瘤微環(huán)境和內吞體/溶酶體

9、雙pH敏感共遞送DOX和基因納米載體CPN/PDT(CPDT)。以期待制備的CPDT除具有腫瘤微環(huán)境和內吞體/溶酶體雙pH敏感特性實現更為可控藥物和基因釋放外,到達腫瘤組織后由于NGR介導轉胞吞作用在腫瘤部位蓄積(第一重促進作用),腫瘤組織pH誘導CPN脫落后暴露的PDT內核由于TAT介導穿細胞膜(第二重促進作用),增加胞內有效藥物和基因濃度。實驗過程中對PPT促進細胞攝取PDT能力進行考察并確定最優(yōu)處方,對PDT體外抗增殖作用進行考察

10、,同時采用Western Blot分析TRAIL蛋白表達。為雙pH敏感共遞送載體進一步應用奠定基礎。
  綜上所述,本課題主要研究腫瘤微環(huán)境和內吞體/溶酶體雙pH敏感納米載體作為共遞送載體可能性以及腫瘤微環(huán)境和內吞體/溶酶體雙pH敏感納米載體共遞送化療藥物DOX和治療基因pTRAIL體外抗腫瘤效果。為腫瘤微環(huán)境和內吞體/溶酶體雙pH敏感共遞送DOX和基因納米載體進一步應用奠定基礎,本課題主要研究方法和結果如下:
  1 DO

11、X含量測定方法學考察
  采用紫外分光光度法測定DOX在pH5.0和pH7.4的PBS中含量,并對方法學進行研究。結果表明此方法簡便快速且專屬性好,在pH5.0和pH7.4的PBS中,DOX濃度在0.05~100μg/mL范圍內與吸光度(A)呈良好線性關系。精密度和回收率均符合規(guī)定。
  2雙pH敏感共遞送DOX和基因納米載體構建和評價
  功能化材料的合成是腫瘤微環(huán)境和內吞體/溶酶體雙pH敏感共遞送DOX和基因納米載

12、體構建的基礎。本課題合成DP和CPN,核磁圖譜驗證結構?;诠δ芑疍P和CPN,采用功能集成組裝技術構建胞內pH敏感DPD和腫瘤微環(huán)境和內吞體/溶酶體雙pH敏感CDPD。選定DP/pDNA最優(yōu)質量比為25∶4制備DPD,同時選定CPN/pDNA最優(yōu)質量比為25∶8制備CDPD。DPD和CDPD外觀形態(tài)圓整,呈球形和類球形。DPD和CDPD平均粒徑分別為80.0±4.2 nm和137.4±2.7 nm,Zeta電位分別為23.59±2.5

13、9 mV和8.25±2.43 mV。體外穩(wěn)定性實驗結果表明,在儲存條件下DPD比CDPD納米粒穩(wěn)定性好,DPD和CDPD納米粒在4℃條件下儲存一周后平均粒徑分別增加了約33.35 nm和83.02 nm,在含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中CDPD比DPD穩(wěn)定性好,DPD和CDPD在37℃與含10% FBS的DMEM孵育24 h后平均粒徑分別增加了約226.48 nm和36.6 nm。體外攝取實驗結果表明,CDPD納米在CD

14、13陽性A549中攝取率(92.49±2.28%)要高于其在CD13陰性HepG2細胞中攝取率(67.82±0.07%,p<0.05)。不同pH條件下體外轉染實驗結果發(fā)現,pH值從7.4降低到6.0,CDPD在HepG2細胞上轉染效率逐漸增高,表明在模擬腫瘤微環(huán)境pH條件下(pH6.0),CPN可從CDPD納米粒表面完全脫落。脫落CPN外殼的DPD內核在模擬內吞體/溶酶體環(huán)境中(0.1M的pH5.0PBS)孵育4h后,可完全釋放DOX并

15、保護pDNA免受破壞。共遞送實驗結果表明,CDPD到達腫瘤部位后暴露DPD內核并有效共遞送DOX和pDNA進細胞。3雙促進雙pH敏感共遞送DOX和pTRAIL納米載體的構建和評價
  為進一步驗證腫瘤微環(huán)境和內吞體/溶酶體雙pH敏感共遞送DOX和基因納米載體優(yōu)勢,并提高胞內有效藥物濃度,殺死腫瘤細胞。合成了促進穿細胞膜PPT,并選定pTRAIL為治療基因。采用DP和PPT摻和壓縮pTRAIL制備腫瘤組織和腫瘤細胞雙促進的腫瘤微環(huán)境

16、和內吞體/溶酶體雙pH敏感共遞送DOX和pTRAIL納米載體內核PPT/DP/pTRAIL(PDT)。瓊脂糖凝膠電泳實驗結果表明,PPT、DP和C6-SANH-PEI材料具有相似的壓縮基因能力,均能夠在質量比為25∶16時將pTRAIL完全壓縮。選定最優(yōu)處方為混合材料與pTRAIL質量比為25∶4,混合材料中PPT占30%。制備的PDT外觀圓整,呈類球形,平均粒徑為80.29±3.66 nm。與游離DOX以及只載pTRAIL納米載體(P

17、PT/C6-SANH-PEI/pTRAIL,PCT)比較,PDT能夠顯著提高在HepG2和A549細胞上的體外抗腫瘤效果。同時Western Blot分析實驗結果顯示,PDT能夠很好地轉染HepG2細胞,提高蛋白表達量。因此制備的雙促進雙pH敏感共遞送DOX和pTRAIL納米載體CPN/PDT(CPDT)具備腫瘤細胞內外雙重敏感的同時,也具腫瘤部位和腫瘤細胞雙重促進作用,因此CPDT除以一種更為可控的方式釋放藥物和基因,還可有效增加胞內

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