葡聚糖磁性納米顆粒的制備及作為基因和藥物載體的研究.pdf

1、研究背景：隨著納米技術(shù)和醫(yī)用高分子材料的發(fā)展，以磁性納米顆粒作為基因和藥物載體具有良好的應(yīng)用前景，引起廣泛的關(guān)注。葡聚糖磁性納米顆粒(DMN)是目前國內(nèi)外導(dǎo)向藥物和醫(yī)用納米材料領(lǐng)域研究的最新成果，在外加磁場作用下，可引導(dǎo)負(fù)載物質(zhì)在體內(nèi)定向移動、定位濃聚(葡聚糖磁性納米顆粒在靶區(qū)的滯留率可高達(dá)100％)。由于葡聚糖磁性納米顆粒是靶向制劑中直徑最小的一種，具有獨(dú)特的界面效應(yīng)，表現(xiàn)出許多優(yōu)異的性能和全新的功能，在體內(nèi)可逃脫巨噬細(xì)胞的吞噬，通過

2、其結(jié)合的配體，選擇性定位，發(fā)揮主動靶向作用。協(xié)同葡聚糖磁性納米顆粒的磁導(dǎo)向作用，可完成對靶器官、靶細(xì)胞甚至到細(xì)胞內(nèi)靶結(jié)構(gòu)的選擇性導(dǎo)入。另外，葡聚糖磁性納米顆粒具有良好的生物相容性和生物可溶解性，無毒無副作用，在溶液中穩(wěn)定性好。與現(xiàn)有的載體相比，安全、特異、可行性好。更重要的是，高分子葡聚糖上的活性基團(tuán)經(jīng)過表面修飾，可同時負(fù)載或包裹多種功能分子(藥物、酶、抗體、肽、DNA及RNA)，并與其有良好的相容性，從而可制備多功能磁性納米材料復(fù)合物

3、，通過選擇理想的靶分子，達(dá)到磁性定位和生物導(dǎo)向雙重定位，使治療媒介理想定位、且穩(wěn)定均勻的分布在腫瘤病灶。國內(nèi)外目前尚未見葡聚糖磁性納米顆粒系統(tǒng)協(xié)同外磁場用于腫瘤靶向生物治療的報道，鑒于目前腫瘤生物靶向治療中存在的種種問題和提高靶向治療水平的迫切需要，開展此項研究具有廣闊的前景和極大的應(yīng)用價值。 研究目的：以葡聚糖磁性納米顆粒作為基因和藥物載體在腫瘤靶向治療中的應(yīng)用得到了迅速發(fā)展，為了能獲得驅(qū)動目的基因高效穩(wěn)定表達(dá)、安全無害、靶向

4、性高、簡便的新型非病毒型基因?qū)?、治療系統(tǒng)和新的藥物傳遞與控釋的載體系統(tǒng)，本文研究(1)葡聚糖氧化鐵磁性納米顆粒的化學(xué)共沉淀法的制備條件對其有效粒徑和比飽和磁化強(qiáng)度的影響，摸索制備的最佳條件；(2)探討葡聚糖磁性納米顆粒作為體外基因載體的可行性；(3)同時為了提高葡聚糖磁性納米顆粒作為抗癌藥物載體時的裝載藥物量和裝載穩(wěn)定性，研究了化學(xué)修飾后的葡聚糖磁性納米顆粒-表阿霉素復(fù)合物在脈沖外電磁場協(xié)同下對人膀胱癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

5、研究方法：采用化學(xué)共沉淀法制作葡聚糖氧化鐵磁性納米顆粒，通過丙稀酰胺葡聚糖凝膠S-300HR色譜和離心法分離葡聚糖氧化鐵磁性納米顆粒，分別用透射電鏡、粒度分析儀和磁化強(qiáng)度分析儀進(jìn)行檢測，研究制備過程中葡聚糖用量、鐵鹽含量、氨水濃度、攪拌速度、離心速度、Fe3+/Fe2+摩爾比、反應(yīng)溫度等反應(yīng)條件對葡聚糖氧化鐵磁性納米顆粒的有效粒徑、比飽和磁化強(qiáng)度的影響。以綠色熒光蛋白質(zhì)粒為靶基因，以葡聚糖氧化鐵磁性納米顆粒作為基因載體，通過高碘酸鈉-硼

6、氫化鈉氧化還原法構(gòu)建葡聚糖磁性納米顆粒-綠色熒光蛋白復(fù)合物，分別用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測兩者的結(jié)合率和結(jié)合力。以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白質(zhì)粒入人膀胱癌細(xì)胞BIU-87作為對照，熒光顯微鏡分別觀察并比較體外轉(zhuǎn)染條件下葡聚糖磁性納米顆粒和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)染效率。然后，對葡聚糖磁性納米顆粒進(jìn)行羧甲基化的化學(xué)修飾后，再通過氧化還原法制備表阿霉素-羧甲基葡聚糖磁性納米顆粒復(fù)合物，分別采用MTT法、Annexin-V/PI雙標(biāo)流

7、式細(xì)胞術(shù)觀察體外表阿霉素-羧甲基葡聚糖磁性納米顆粒復(fù)合物對BIU-87細(xì)胞增值和凋亡效應(yīng)的影響及其聯(lián)合恒定脈沖外電磁場的協(xié)同效應(yīng)。 研究結(jié)果：(1)不同制備條件影響著葡聚糖氧化鐵磁性納米顆粒有效粒徑和比飽和磁化強(qiáng)度的大小，電鏡觀察DMN直徑最小為3nm，最大為50nm；粒度分析儀檢測其有效粒徑在42.7nm～189.1nm之間，比飽和磁化強(qiáng)度在0.16emu/g～0.38emu/g之間。隨著化學(xué)共沉淀法制備過程中鐵鹽總量的增加，

8、有效粒徑和比飽和磁化強(qiáng)度隨著而增大；而隨著葡聚糖用量、攪拌速度、離心速度、反應(yīng)溫度等的增加，有效粒徑和比飽和磁化強(qiáng)度變小；此外Fe3+/Fe2+摩爾比、氨水用量等對其都有一定影響。(2)制備出來的葡聚糖磁性納米顆粒-綠色熒光蛋白復(fù)合物直徑在3～8nm之間，有效粒徑為59.2nm，比飽和磁化強(qiáng)度為0.23emu/g。分別經(jīng)10mmol/L的高碘酸鈉氧化、0.5mol/L的硼氫化鈉還原作用后的葡聚糖磁性納米顆粒和綠色熒光蛋白的結(jié)合比例和結(jié)合

9、力最大，葡聚糖磁性納米顆粒作為基因載體時對綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)染效率最高可達(dá)45％左右，明顯高于脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率。(3)表阿霉素-羧甲基葡聚糖磁性納米顆粒復(fù)合物直徑為8～10nm，有效粒徑為84.2nm，比飽和磁化強(qiáng)度為0.22emu/g，表阿霉素的含量為15.38％。MTT和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果均表明含表阿霉素濃度為0.2μg/ml的磁性納米顆粒復(fù)合物可顯著抑制BIU-87細(xì)胞的生長，抑制率為(13.86±2.31)％，并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，凋亡率

10、為(9.48±1.54)％。脈沖外電磁場(5mT)也可抑制BIU-87細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)發(fā)生凋亡，且兩者的協(xié)同作用對BIU-87細(xì)胞的生長抑制和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的效應(yīng)均顯著增強(qiáng)，抑制率和凋亡率分別為(21.82±3.18)％、(16.79±3.37)％。 研究結(jié)論：(1)制備反應(yīng)條件對葡聚糖氧化鐵磁性納米顆粒有效粒徑和比飽和磁化強(qiáng)度的影響符合化學(xué)共沉淀反應(yīng)的一般規(guī)律，可以用化學(xué)沉淀反應(yīng)的理論指導(dǎo)葡聚糖磁性納米顆粒的制備。化學(xué)共沉淀法

11、制備簡單，反應(yīng)條件容易控制，制備出來的葡聚糖磁性納米顆粒具有良好的生物相容性和生物可溶解性、特殊的納米效應(yīng)、超順磁性、無毒無副作用，在溶液中穩(wěn)定性好，具有較好的具有較好的單分散性。(2)葡聚糖磁性納米顆粒上的高分子葡聚糖上的活性基團(tuán)可通過經(jīng)典的氧化還原反應(yīng)與功能分子，如質(zhì)粒DNA相連，在細(xì)胞攝粒作用下進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在體外可將綠色熒光蛋白基因成功轉(zhuǎn)染入人膀胱癌BIU-87細(xì)胞。(3)化學(xué)修飾后的羧甲基葡聚糖磁性納米顆粒也可通過氧化還原反應(yīng)可