殼聚糖-siRNA分子納米載體的制備、鑒定和基因沉默效應(yīng).pdf

1、RNA干擾(RNA interference,RNAi)是生物體內(nèi)的一種自然現(xiàn)象：導(dǎo)入生物體內(nèi)的或內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄生成的一種雙鏈RNA分子，與同源的mRNA結(jié)合并使其降解，可介導(dǎo)對應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄后的沉默。一方面，干擾RNA技術(shù)可作為研究和鑒別基因表型及功能的強(qiáng)有力工具，為疾病發(fā)生機(jī)理、疾病基因治療靶點(diǎn)的鑒別以及新藥研發(fā)如小分子化合物和抗體類藥物的發(fā)現(xiàn)提供理論依據(jù)；另一方面，在前面研究的基礎(chǔ)上，干擾RNA技術(shù)可用于人體疾病的治療。小分子干擾RNA(

2、small intefering RNA，siRNA)是RNAi基因抑制功能的效應(yīng)分子，具有核酸和小分子化合物的雙重特性，易被核酸酶降解，具有穩(wěn)定性差、半衰期短、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染效率低和靶向性差等缺點(diǎn)，因此，應(yīng)用siRNA分子的關(guān)鍵是如何有效地使其穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中的RNAi通路。陽離子脂質(zhì)體、病毒載體、一些物理技術(shù)如基因槍和電轉(zhuǎn)染等均可介導(dǎo)其轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。但是，將siRNA分子導(dǎo)入生物體內(nèi)治療疾病要復(fù)雜得多。病毒載體基因轉(zhuǎn)染率高，但

3、具有潛在的致癌性和免疫原性；陽離子脂質(zhì)體具有較大的細(xì)胞毒性和不穩(wěn)定性。近年來，有文獻(xiàn)報(bào)道使用陽離子聚合物殼聚糖作為核酸類分子的載體，在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和生物體內(nèi)應(yīng)用都取得了較好的效果。 殼聚糖(chitosan，α(1-4)2-amino-2-deoxy-β-D-glucan)是一種極具潛力的天然陽離子多聚糖，提取自海洋甲殼類生物，是甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物。殼聚糖來源廣泛，具有較好的生物相容性和生物可降解性，低毒，低免疫原性。因此，殼

4、聚糖被廣泛地應(yīng)用于藥劑學(xué)研究、制藥工業(yè)以及生物材料工程(如人工皮膚)等方面。近年來，有人嘗試將殼聚糖作為基因藥物的生物體外及生物體內(nèi)給藥系統(tǒng)，取得了很好的效果。殼聚糖是唯一一個(gè)具有弱堿性的多糖，在酸性溶液中，殼聚糖分子中的氨基基團(tuán)解離，使多糖帶上高密度的正電荷，因而能與帶負(fù)電荷的核酸通過靜電作用結(jié)合，自聚集形成納米?；蛭⒘＃瑢怂岱肿泳哂幸欢ǔ潭鹊谋Ｗo(hù)作用，使其免受核酸酶的降解。殼聚糖與核酸聚集形成的微粒易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)攝取，經(jīng)細(xì)胞內(nèi)吞

5、進(jìn)入胞內(nèi)，在溶酶體中殼聚糖被降解，釋放出核酸分子。殼聚糖還具有黏膜黏著劑的性質(zhì)，與核酸聚集形成的微粒容易被粘膜上皮細(xì)胞攝取，并能將核酸分子帶過粘膜細(xì)胞，增強(qiáng)核酸分子的轉(zhuǎn)染能力。因此，殼聚糖聚合物能有效地解決基因轉(zhuǎn)染過程中的一些關(guān)鍵問題，如細(xì)胞吸收、胞內(nèi)的釋放和核定位等，作為基因遞送載體的應(yīng)用前景看好。siRNA分子同為核酸類分子，為了探索殼聚糖作為siRNA載體的可行性，本研究中以殼聚糖為載體材料，采用復(fù)凝聚法制備了載質(zhì)粒DNA的殼聚糖

6、納米粒，對其結(jié)構(gòu)特征(structural feature)進(jìn)行了鑒定、對細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行了測定；并制備了載siRNA分子的殼聚糖納米粒，研究了其在體外細(xì)胞水平對目的基因FHL2的RNAi效應(yīng)，為進(jìn)一步的體內(nèi)應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。 目的： 1．探討聚陽離子殼聚糖納米粒作為siRNA分子給藥系統(tǒng)的可行性。 2．制備載報(bào)告基因pGFP的殼聚糖納米粒，研究納米粒的結(jié)構(gòu)特征以及對體外細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染效率，證明殼聚糖能作

7、為DNA類核酸類分子的載體。 3．制備載siRNA分子的殼聚糖納米粒，研究納米粒能否將siRNA分子遞送到體外培養(yǎng)的細(xì)胞中，證明殼聚糖能作為sirNA分子的給藥載體。 4．研究所制備的殼聚糖納米粒能否介導(dǎo)siFHL2分子有效轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并沉默靶基因：FHL2的表達(dá)。 方法： 1．用表達(dá)綠色熒光蛋白的質(zhì)粒(plasmid)pGFP作報(bào)告基因，采用復(fù)凝聚法制備殼聚糖-pGFP納米粒。1.0％瓊脂糖凝膠電泳分析殼

8、聚糖和pDNA的結(jié)合能力，通過比色法檢測其包封率，用原子力顯微鏡、掃描電子顯微鏡和激光納米粒度儀對納米粒的形態(tài)和粒徑分布進(jìn)行考察。 2．殼聚糖-pGFP納米粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系LoVo，通過熒光顯微鏡觀察LoVo細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，用脂質(zhì)體(Iffpofectamine2000)轉(zhuǎn)染pGFP作為陽性對照，考察殼聚糖納米粒介導(dǎo)pGFP對LoVo細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。 3．用FAM標(biāo)記對照sirNA分子，復(fù)凝

9、聚法制備殼聚糖．對照siRNA納米粒，體外轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞，用激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal microscopy)觀察LoVo細(xì)胞中的綠色熒光(代表轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞的siRNA分子)，考察殼聚糖納米粒介導(dǎo)siRNA對LoVo細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效應(yīng)及其在細(xì)胞中的分布。 4．合成能特異性沉默靶基因FHL2的siRNA分子(siFHL2)，復(fù)凝聚法制備殼聚糖-siFHL2納米粒，體外轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siFHL2作為陽性對照，

10、同時(shí)轉(zhuǎn)染殼聚糖一對照siRNA納米粒作為對照。采用半定量RT-PCR方法(semi-quantitative RT-PCR)檢測LoVo細(xì)胞中FHL2 mRNA的表達(dá)水平，考察殼聚糖納米粒介導(dǎo)siFHL2分子轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞后對FHL2基因的RNAi效應(yīng)。siFHL2分子的序列為： 正義鏈：5’-CGAAUCUCUCUUUGGCAAGdTdT-3’； 反義鏈：5’-dTdTGCUUAGAGAGAAACCGUUC-3’。

11、 GAPDH的PCR引物序列為： 正義鏈(GF)：5’-AAGGTCATCCCAGAGCTGAA-3’； 反義鏈(GR)：5’-ATGTAGGCCATGAGGTCCAC-3’。 FHL2的PCR引物序列為： 正義鏈(FF)：5’-ATGACTGAGCGCTTTGACTG-3’； 反義鏈(FR)：5’-AGTTCAGGCAGTAGGCAAAGTC-3’。 結(jié)果： 1．制備得到殼

12、聚糖-pGFP納米粒。經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳分析，大部分pGFP均滯留在加樣孔中，說明pDNA與殼聚糖之間通過靜電作用而幾乎完全結(jié)合；比色法測得殼聚糖對質(zhì)粒的囊化率大于90％。原子力顯微鏡下見殼聚糖-pGFP納米粒為結(jié)構(gòu)緊密的不規(guī)則球形，粒徑略小于200 nm，激光納米粒度儀測得平均粒徑為209nm，多分散指數(shù)為0.15。掃描電鏡下觀察到納米粒凍干粉(lyophillization)形狀不規(guī)則，呈膨松的片層狀或樹枝狀，乙醇分散后呈梭形

13、顆粒，大小不均。 2．將殼聚糖-pGFP納米粒體外轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞后，熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞中有綠色熒光表達(dá)，說明殼聚糖能介導(dǎo)pGFP轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞并在細(xì)胞中表達(dá)GFP蛋白。殼聚糖納米粒轉(zhuǎn)染組表達(dá)綠色熒光蛋白細(xì)胞比脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組少，說明殼聚糖納米粒的轉(zhuǎn)染效率比脂質(zhì)體低。 3．制備得到殼聚糖．對照siRNA納米粒。將納米粒體外轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞后，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，大部分細(xì)胞中均有綠色的熒光點(diǎn)，即為轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞的s

14、iRNA分子。這些綠色熒光點(diǎn)主要分布于胞漿中，沿胞膜內(nèi)側(cè)和核膜(nuclear membrane)胞漿側(cè)也有分布，與脂質(zhì)體-siRNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染組一致，而陰性對照組細(xì)胞中則無綠色熒光點(diǎn)。說明脂質(zhì)體復(fù)合物和殼聚糖納米粒均將對照siRNA分子遞送入了LoVo細(xì)胞中。 4．制備得到殼聚糖-siFHL2納米粒，體外轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞后，提取各組LoVo細(xì)胞總RNA，分別用RT-PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。灰度掃描目的條帶后對各組

15、間FHL2 mRNA的相對表達(dá)量行單向方差分析(one-wayANOVA)，結(jié)果具有顯著性差異(F=1138.441，P<0.001)。再對各組間。FHL2mRNA的相對表達(dá)量行多重比較(LSD檢驗(yàn))，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，殼聚糖納米粒能介導(dǎo)siRNA分子特異性沉默靶基因FHL2的表達(dá)，與對照組相比均有顯著性差異(P<0.001)，與脂質(zhì)體復(fù)合物轉(zhuǎn)染組相比無顯著性差異(P=0.219)；而對照siRNA分子即使進(jìn)入細(xì)胞也不能對靶基因產(chǎn)生RNAi

16、效應(yīng)，與正常細(xì)胞對照組比較無顯著性差異(P=0.298)。 結(jié)論： 1．殼聚糖可以有效凝聚pDNA，采用復(fù)凝聚法可制得粒徑在100～500 nm范圍帶正電荷的納米粒，有較高的包封率。納米粒冷凍干燥過程中聚集，導(dǎo)致形態(tài)和粒徑均產(chǎn)生較大的變化。 2．殼聚糖納米粒在體外能將質(zhì)粒DNA遞送到細(xì)胞內(nèi)，且報(bào)告基因能在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。 3．殼聚糖納米粒可以將siRNA分子遞送進(jìn)入體外培養(yǎng)的細(xì)胞中，并對靶基因產(chǎn)生特異性的RN