過(guò)氧化氫在肝硬化門(mén)靜脈高壓癥高動(dòng)力循環(huán)中的作用.pdf

1、門(mén)靜脈高壓癥（portal hypertension，PHT）是肝硬化的嚴(yán)重并發(fā)癥之一。其始動(dòng)因素是肝內(nèi)阻力增加，繼發(fā)因素是門(mén)靜脈系統(tǒng)的高血流量維持著門(mén)靜脈的高壓狀態(tài)。這進(jìn)一步導(dǎo)致門(mén)體側(cè)支循環(huán)廣泛形成，這些側(cè)支血管雖然在一定程度上減少了門(mén)靜脈血流，但由于內(nèi)臟血流量的增加，最終形成內(nèi)臟高動(dòng)力循環(huán)。
　　PHT時(shí)內(nèi)臟高血流動(dòng)力循環(huán)至少部分依賴(lài)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEG

2、F）介導(dǎo)的血管增生。研究表明，應(yīng)用VEGF受體-2（VEGF receptor-2，VEGFR-2）阻滯劑能顯著抑制門(mén)靜脈部分結(jié)扎（partial portal vein ligation，PPVL）大鼠門(mén)體側(cè)支循環(huán)的建立，降低內(nèi)臟器官血流量，改善大鼠內(nèi)臟高動(dòng)力血流狀態(tài)。然而，PHT時(shí)調(diào)節(jié)VEGF介導(dǎo)的內(nèi)臟血管增生的機(jī)制仍不清楚。研究表明，過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）參與調(diào)節(jié)VEGF介導(dǎo)的血管增生。我們前期研

3、究也發(fā)現(xiàn)，PHT大鼠體內(nèi)H2O2水平顯著高于正常對(duì)照組，降低體內(nèi)H2O2水平顯著改善PHT大鼠腸系膜微動(dòng)脈對(duì)縮血管物質(zhì)的低反應(yīng)性，緩解內(nèi)臟高動(dòng)力循環(huán)狀態(tài)。并且，PHT時(shí)機(jī)體氧化應(yīng)激水平增高，活性氧（reactive oxygen species，ROS）如超氧陰離子（O2·-）產(chǎn)生顯著增加，NAD(P)H氧化酶抑制劑（apocynin）能顯著降低氧化應(yīng)激水平，減少門(mén)體分流，改善內(nèi)臟高動(dòng)力循環(huán)，并下調(diào)腸系膜 VEGF、VEGFR-2和血小

4、板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1/CD31）蛋白表達(dá)。CD31是血管密度的標(biāo)志，其水平的下調(diào)，也意味著經(jīng)apocynin處理后的PHT大鼠，其腸系膜血管增生受到顯著抑制。那么，H2O2作為另一種形式的ROS，其在PHT內(nèi)臟血管增生以及門(mén)體側(cè)支循環(huán)建立過(guò)程中的作用及機(jī)制值得進(jìn)一步探索。
　　本研究采用CCL4誘導(dǎo)肝硬化大鼠模型，以H2O2

5、為阻斷靶點(diǎn)，觀測(cè)大鼠血流動(dòng)力學(xué)及VEGF等蛋白表達(dá)水平的變化，探討H2O2對(duì)PHT內(nèi)臟血管增生和側(cè)支循環(huán)建立的影響機(jī)制。
　　第一部分：CCL4誘導(dǎo)肝硬化PHT大鼠模型的制備
　　目的：注射 CCL4油溶液誘導(dǎo)肝硬化 PHT大鼠模型。方法：雄性 SD大鼠簡(jiǎn)單隨機(jī)分為正常對(duì)照組（N組）和肝硬化門(mén)靜脈高壓組（PHT組），PHT組背部皮下注射50％的CCL4油溶液，0.5mL/100g大鼠體重，每周注射兩次，連續(xù)16周，同時(shí)間斷飲

6、用5%乙醇；N組以同樣的方式和劑量在背部皮下注射生理鹽水。16周后，測(cè)定門(mén)靜脈壓力（portal vein pressure，PP）、平均動(dòng)脈壓（Mean Arterial Pressure，MAP）和心率（Heart Rate,HR）；并進(jìn)行肝臟組織切片HE染色。結(jié)果：①大體觀：PHT組大鼠體重較N組大鼠低，精神不佳，毛發(fā)稀疏脫落，肝臟可見(jiàn)彌漫性結(jié)節(jié)，質(zhì)地堅(jiān)韌，腹腔可見(jiàn)淡黃色腹水；②鏡下觀：PHT組大鼠HE切片可見(jiàn)肝臟原有結(jié)構(gòu)破壞，纖

7、維廣泛增生包繞不規(guī)則再生的肝細(xì)胞，形成特征性的假小葉結(jié)構(gòu)。③PHT大鼠 MAP顯著低于N組大鼠（130.17±5.0 vs107.86±10.17，p<0.001）；PHT大鼠PP顯著高于N組大鼠（15.00±1.64 vs6.04±0.5，p<0.001）；兩組大鼠心率無(wú)顯著變化。結(jié)論：CCL4誘導(dǎo)法能夠成功復(fù)制出肝硬化PHT大鼠模型，且大鼠耐受性良好，無(wú)明顯不良反應(yīng)發(fā)生。
　　第二部分：檢測(cè)肝硬化 PHT大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)并研

8、究過(guò)氧化氫在 PHT大鼠血流動(dòng)力學(xué)中的作用
　　目的：應(yīng)用非放射性彩色微球測(cè)定大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，研究過(guò)氧化氫對(duì)肝硬化PHT大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響。方法：不同組大鼠行股動(dòng)脈插管、左心室插管及門(mén)靜脈插管，運(yùn)用DYE-TRAK彩色微球血流測(cè)量系統(tǒng)測(cè)定大鼠內(nèi)臟器官血流量，并通過(guò)公式計(jì)算其他血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。結(jié)果：PHT組大鼠心指數(shù)（cardiac index，CI）、門(mén)體分流率（portosystemic collateral vess

9、els，PSS）、門(mén)靜脈血流量（portal venous inflow，PVI）、肝內(nèi)阻力（intrahepatic resistance，IHR）顯著高于對(duì)照組大鼠；PHT大鼠周?chē)傋枇Γ╰otal peripheric resistance，TPR）、內(nèi)臟動(dòng)脈阻力（splanchnic arteriolar resistance，SAR）、側(cè)支血管阻力（portal-collateral resistance，PCR）顯著低于N組

10、大鼠；其余指標(biāo)沒(méi)有顯著變化；經(jīng)過(guò) H2O2抑制劑處理后，PHT大鼠PSS、PVI、顯著下降，SAR、PCR、門(mén)靜脈阻力（portal venous resistance,PVR）顯著上升，其余指標(biāo)未見(jiàn)顯著變化。其中，H2O2抑制劑降低 PVI，主要是因?yàn)橐种屏四c系膜及小腸的血流量。結(jié)論：非放射性彩色微球血流量測(cè)定系統(tǒng)穩(wěn)定可靠。肝硬化PHT大鼠體內(nèi)呈現(xiàn)明顯高動(dòng)力循環(huán)狀態(tài)，H2O2參與肝硬化PHT大鼠內(nèi)臟高動(dòng)力循環(huán)狀態(tài)的形成。
　　第

11、三部分：過(guò)氧化氫影響肝硬化PHT血流動(dòng)力學(xué)的機(jī)制
　　目的：探討H2O2影響肝硬化PHT大鼠內(nèi)臟高動(dòng)力循環(huán)的機(jī)制。方法：過(guò)氧化氫試劑盒測(cè)定比較大鼠內(nèi)臟器官的H2O2水平，蛋白免疫印跡法測(cè)定比較大鼠腸系膜及小腸VEGF、VEGFR-2和CD31蛋白水平。結(jié)果：PHT組大鼠胃、腸系膜、小腸及結(jié)腸的H2O2水平顯著高于對(duì)照組大鼠；PHT組大鼠腸系膜及小腸 VEGF、VEGFR-2和CD31蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組大鼠；H2O2抑制劑顯著降