鴨細(xì)胞因子克隆表達(dá)及ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、細(xì)胞因子是由細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)，在炎癥和免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用，主要參與激活和調(diào)節(jié)其他細(xì)胞和組織。目前對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞因子研究較多，但對(duì)禽類(lèi)細(xì)胞因子的作用以及它們相應(yīng)的蛋白質(zhì)研究甚少。原因是因?yàn)榍蓊?lèi)與哺乳動(dòng)物同源細(xì)胞因子的序列相似度很低。隨著禽類(lèi)遺傳學(xué)和免疫學(xué)的新發(fā)現(xiàn)，研究者開(kāi)始探索健康和疾病狀態(tài)中的細(xì)胞因子。櫻桃谷鴨作為禽類(lèi)養(yǎng)殖的重要品種之一，對(duì)其細(xì)胞因子的研究較少，制約著對(duì)其免疫機(jī)制的深入研究;同時(shí)研究表明，在一些疾病的發(fā)生過(guò)程中，某

2、些細(xì)胞因子的水平會(huì)發(fā)生明顯的變化。因此，本研究對(duì)鴨IFN-γ、IL-2、TNF-α基因進(jìn)行克隆，然后在原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行重組蛋白表達(dá);以此為基礎(chǔ)，制備相應(yīng)的單克隆抗體和多克隆抗體，并初步建立鴨IFN-γ抗原捕獲ELISA方法，為研究禽類(lèi)細(xì)胞因子在免疫系統(tǒng)中的作用提供技術(shù)支持。
　　1、鴨IFN-γ、IL-2、TNF-α克隆、表達(dá)及蛋白純化
　　依據(jù)GenBank上發(fā)表的綠頭鴨IFN-γ基因序列、番鴨IL-2基因序列、雞TNF

3、-α基因序列分別設(shè)計(jì)特異性引物，提取櫻桃谷鴨脾臟淋巴細(xì)胞的總RNA，通過(guò)RT-PCR和3'RACE和5'RACE技術(shù)，成功擴(kuò)增到鴨的IFN-γ、IL-2和TNF-α基因，對(duì)鴨的IFN-γ、IL-2和TNF-α基因進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明本研究通過(guò)RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增得到的櫻桃谷鴨IFN-γ、IL-2(去除信號(hào)肽部分)和TNF-α基因的ORF序列大小分別為495bp、363bp、447bp;利用3'RACE和5'RACE技術(shù)獲得的鴨TNF-α基

4、因序列全長(zhǎng)為1049bp。序列分析表明，櫻桃谷鴨IFN-γ與綠頭鴨IFN-γ的編碼區(qū)核苷酸和氨基酸同源性分別為99.6％和98.8％，櫻桃谷鴨IL-2與番鴨IL-2的編碼區(qū)（去除信號(hào)肽部分）核苷酸和氨基酸同源性分別為98％和94％，櫻桃谷鴨TNF-α與雞TNF-α的編碼區(qū)核苷酸和氨基酸同源性分別為99.6％和100％。將鴨的IFN-γ、IL-2和TNF-α基因分別克隆至原核表達(dá)載體pCold TF DNA中，構(gòu)建重組表達(dá)載體pCold-

5、DuIFNγ、pCold-DuIL2和pCold-DuTNFα，將構(gòu)建的重組表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG低溫(15℃)誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)的重組蛋白經(jīng)親和層析進(jìn)行純化。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果表明，這三個(gè)基因在大腸桿菌BL21(DE3)中均以可溶性方式獲得表達(dá)，融合蛋白相對(duì)分子質(zhì)量分別約為70kDa、65kDa和68kDa。重組蛋白的成功表達(dá)、純化為單克隆抗體和多克隆抗體的制備奠定了基礎(chǔ)。
　　2、鴨IFN-γ、

6、IL-2、TNF-α的抗體制備
　　1)單克隆抗體制備:將純化的重組蛋白與佐劑等體積乳化，每隔兩周于皮下注射免疫BALB/c小鼠，并在融合前3天腹腔注射無(wú)佐劑的重組蛋白。通過(guò)間接ELISA篩選出血清效價(jià)最高的小鼠進(jìn)行單抗制備，將小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)HAT培養(yǎng)基和間接ELISA法篩選，并進(jìn)行有限稀釋法亞克隆，獲得穩(wěn)定性分泌單克隆抗體，其中鴨IFN-γ單抗3株、IL-2單抗3株、TNF-α單抗3株。間接ELISA檢

7、測(cè)結(jié)果表明，所獲得的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞制備的小鼠腹水的效價(jià)在1∶25，600～1∶51，200之間。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，所獲得的單克隆抗體具有良好的反應(yīng)原性。
　　2）多克隆抗體制備:每隔3周于皮下注射免疫新西蘭大白兔制備細(xì)胞因子抗血清，在最后一次免疫后14天收集兔血清，其效價(jià)在1∶12，800～1∶51，200之間。本研究成功制備了鴨IFN-γ、IL-2、TNF-α的單克隆抗體和多克隆抗體，為下步細(xì)胞因子檢測(cè)方法的

8、建立奠定了基礎(chǔ)。
　　3、鴨IFN-γ抗原捕獲ELISA檢測(cè)方法的建立
　　將鴨IFN-γ單克隆抗體作為捕獲抗體，鴨IFN-γ多克隆抗體作為檢測(cè)抗體，建立檢測(cè)鴨IFN-γ的抗原捕獲ELISA方法，通過(guò)對(duì)抗體濃度、封閉液等條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了單克隆抗體的最佳包被濃度為0.8μg/mL，多克隆抗體的最佳稀釋度為1∶2，000(濃度為0.8μg/mL)，最佳包被時(shí)間為4℃過(guò)夜，最佳封閉時(shí)間為1.5h，最佳封閉液為1％BSA溶液，最