林麝IL-2細胞因子的克隆、分析和表達.pdf

1、麝被列入國家I類瀕危動物，同時又是重要的經(jīng)濟動物，其所產(chǎn)麝香是我國和東亞地區(qū)重要的中藥成份。我國具有多年的麝馴化和人工養(yǎng)殖歷史，但是在麝的種群數(shù)和重大疾病防治上一直沒有取得大得突破，而這兩者都與細菌性感染疾病相關。林麝(Moschus berezovskii)作為目前麝的馴化和人工養(yǎng)殖中相對最成功、養(yǎng)殖規(guī)模最大、管理經(jīng)驗最成熟、研究最多的一種動物，其養(yǎng)殖和保護工作也就具有重要的代表意義和經(jīng)濟價值。白介素-2(Inerleukin-2，I

2、L-2)是體內(nèi)重要的免疫細胞因子之一，具有促進免疫細胞存活和增殖、增強細胞應答和體液應答水平，調(diào)節(jié)機體自身免疫等作用，臨床上被積極應用于包括重建免疫體系、增強免疫應答水平、預防或治療細菌和病毒感染、輔助其他物理或化學治療等領域。因此,為了應用細胞因子對麝進行免疫治療，提高麝對外界環(huán)境的自身免疫水平，克隆、分析并表達了林麝IL-2基因。以偶蹄目水牛(Bubalus bubalis，GenBank 登錄號F363786)、綿羊(Ovisar

3、ies,GenBank登錄號X55641)、馬鹿(Cervus etaphus，GenBank登錄號AY52368)3個物種的IL-2開放閱讀框(open reading frame，ORF)為參考，在ORF上下游保守區(qū)域設計了克隆引物，并以從體外培養(yǎng)的林麝外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中提取的總RNA做為模板，采用RT-PCR技術擴增林麝IL-2的ORF，經(jīng)T-A克隆轉化

4、到大腸桿菌并測序。 結果林麝IL-2的ORF全長468bp,編碼155氨基酸，與水牛和綿羊的IL-2高度相似。根據(jù)IL-2序列，對偶蹄目物種建立進化樹，結果支持了麝獨立分科的觀點。 由于林麝IL-2在其受體結合域上與綿羊IL-2的氨基酸殘基不同，而且與水牛IL-2之間存在蛋白翻譯后修飾的很大差異(軟件預測)，因此我們對林麝IL-2基因在大腸桿菌和畢赤酵母中的表達情況進行了研究和比較。將林麝IL-2基因與質(zhì)粒pGEX4T-

5、1連接，轉化大腸桿菌BL21，在IPTG誘導下，該基因在大腸桿菌中得到了表達，SDS-PAGE分析得到了約41 kD的誘導表達帶，與融合蛋白的預計分子量一致，表達量約占細菌裂解物的25[％]。將林麝IL-2基因與質(zhì)粒pPIC9K連接，轉化大腸桿菌JMl09，通過測序篩選正確構建的重組質(zhì)粒并轉化畢赤酵母GSll5細胞，G418抗性篩選得到了0.5mg/ml G418抗性的重組酵母；這些酵母經(jīng)優(yōu)化的酵母菌落PCR方法篩選和鑒定，得到多個陽性