林麝IL-2細(xì)胞因子的克隆、分析和表達(dá).pdf

1、麝被列入國家I類瀕危動(dòng)物，同時(shí)又是重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，其所產(chǎn)麝香是我國和東亞地區(qū)重要的中藥成份。我國具有多年的麝馴化和人工養(yǎng)殖歷史，但是在麝的種群數(shù)和重大疾病防治上一直沒有取得大得突破，而這兩者都與細(xì)菌性感染疾病相關(guān)。林麝(Moschus berezovskii)作為目前麝的馴化和人工養(yǎng)殖中相對(duì)最成功、養(yǎng)殖規(guī)模最大、管理經(jīng)驗(yàn)最成熟、研究最多的一種動(dòng)物，其養(yǎng)殖和保護(hù)工作也就具有重要的代表意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。白介素-2(Inerleukin-2，I

2、L-2)是體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞因子之一，具有促進(jìn)免疫細(xì)胞存活和增殖、增強(qiáng)細(xì)胞應(yīng)答和體液應(yīng)答水平，調(diào)節(jié)機(jī)體自身免疫等作用，臨床上被積極應(yīng)用于包括重建免疫體系、增強(qiáng)免疫應(yīng)答水平、預(yù)防或治療細(xì)菌和病毒感染、輔助其他物理或化學(xué)治療等領(lǐng)域。因此,為了應(yīng)用細(xì)胞因子對(duì)麝進(jìn)行免疫治療，提高麝對(duì)外界環(huán)境的自身免疫水平，克隆、分析并表達(dá)了林麝IL-2基因。以偶蹄目水牛(Bubalus bubalis，GenBank 登錄號(hào)F363786)、綿羊(Ovisar

3、ies,GenBank登錄號(hào)X55641)、馬鹿(Cervus etaphus，GenBank登錄號(hào)AY52368)3個(gè)物種的IL-2開放閱讀框(open reading frame，ORF)為參考，在ORF上下游保守區(qū)域設(shè)計(jì)了克隆引物，并以從體外培養(yǎng)的林麝外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中提取的總RNA做為模板，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增林麝IL-2的ORF，經(jīng)T-A克隆轉(zhuǎn)化

4、到大腸桿菌并測(cè)序。 結(jié)果林麝IL-2的ORF全長(zhǎng)468bp,編碼155氨基酸，與水牛和綿羊的IL-2高度相似。根據(jù)IL-2序列，對(duì)偶蹄目物種建立進(jìn)化樹，結(jié)果支持了麝獨(dú)立分科的觀點(diǎn)。 由于林麝IL-2在其受體結(jié)合域上與綿羊IL-2的氨基酸殘基不同，而且與水牛IL-2之間存在蛋白翻譯后修飾的很大差異(軟件預(yù)測(cè))，因此我們對(duì)林麝IL-2基因在大腸桿菌和畢赤酵母中的表達(dá)情況進(jìn)行了研究和比較。將林麝IL-2基因與質(zhì)粒pGEX4T-

5、1連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，在IPTG誘導(dǎo)下，該基因在大腸桿菌中得到了表達(dá)，SDS-PAGE分析得到了約41 kD的誘導(dǎo)表達(dá)帶，與融合蛋白的預(yù)計(jì)分子量一致，表達(dá)量約占細(xì)菌裂解物的25[％]。將林麝IL-2基因與質(zhì)粒pPIC9K連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JMl09，通過測(cè)序篩選正確構(gòu)建的重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSll5細(xì)胞，G418抗性篩選得到了0.5mg/ml G418抗性的重組酵母；這些酵母經(jīng)優(yōu)化的酵母菌落PCR方法篩選和鑒定，得到多個(gè)陽性