豬細胞因子檢測方法的建立與初應(yīng)用.pdf

1、細胞因子(Cytokine)是由免疫細胞和某些非免疫細胞經(jīng)刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)，細胞因子的檢測可以用于多種疾病(感染、炎癥、自身免疫病等)的輔助診斷及疫苗接種后的細胞免疫功能評價，對于研究病毒感染后病毒與宿主免疫系統(tǒng)相互作用機制也同樣具有重要意義。
　　 細胞因子是一個龐大的體內(nèi)功能群體，其檢測方法很多。根據(jù)檢測原理和技術(shù)手段，可將細胞因子的檢測技術(shù)大致分為免疫學(xué)方法、生物學(xué)方法和分子生物學(xué)方法

2、等三類。目前較為常用的有酶聯(lián)免疫斑點試驗(ELISPOT)、熒光定量RT-PCR、細胞內(nèi)細胞因子檢測、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)等。
　　 ELISPOT技術(shù)是在溶血空斑技術(shù)和ELISA技術(shù)基礎(chǔ)之上建立起來的現(xiàn)代免疫學(xué)檢測技術(shù)，實現(xiàn)了對細胞因子進行單細胞水平上的精確定量檢測。目前ELISPOT技術(shù)在全球尚未完全標準化，研究人員必須采用最佳匹配的包被抗體和檢測抗體、ELISPOT板、形成斑點的底物及其顯色時間等，因此在實際操作中需

3、對各個因素進行優(yōu)化方能建立較為穩(wěn)定的檢測體系。
　　 熒光定量PCR技術(shù)是將特異的熒光基團加入到PCR反應(yīng)體系中，根據(jù)對熒光信號的實時檢測并做出精確的定量分析，目前該技術(shù)在病原體檢測等方面已得到廣泛應(yīng)用。當前熒光定量主要包括SYBR GreenⅠ和TaqMan探針法兩種。SYBR Green I是一種能夠于雙鏈DNA非特異結(jié)合的熒光染料，適用于所有引物的擴增，方法簡便，成本較低，但熒光染料能夠與dsDNA結(jié)合，因此能與引物二聚體

4、或者非特異性擴增產(chǎn)物結(jié)合，需要和熔解曲線分析加以辨別去除影響。而TaqMan探針法是將帶有熒光標記探針加入到PCR反應(yīng)體系中，對引物設(shè)計要求更高，但同時檢測的特異性更高，結(jié)果更為可靠。
　　 近年來，豬細胞免疫的研究逐漸引起人們的重視。豬是一種重要的經(jīng)濟動物。豬群易受多種傳染病侵害，豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征(即豬藍耳病)等都給世界各地的養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的經(jīng)濟損失。了解病毒與豬免疫系統(tǒng)之間相互作用的機制，尤其是細胞免疫應(yīng)答機制，既

5、有助于防治豬病毒性疾病，也有助于對新型疫苗誘發(fā)的免疫效應(yīng)進行評價。此外，豬也是重要的實驗動物，豬在解剖、組織和生理生化等許多生物學(xué)指標上與人類非常相似，被認為是研究人類疾病最合適的實驗動物模型。豬作為實驗動物已常被用作異種移植排斥反應(yīng)的模型，因此對其免疫系統(tǒng)及免疫應(yīng)答情況的研究對于該方面的研究也具有重要意義。
　　 在本研究中，我們著重研究了豬細胞因子的檢測方法。我們利用五指山小型豬這一實驗用小型豬，建立了豬細胞因子的檢測方法，

6、包括豬IFN-γ的ELISPOT檢測方法及豬IL-2、IL-4、IL-10的實時定量RT-PCR檢測方法。
　　 在建立豬IFN-γ，的ELISPOT檢測方法時，我們選擇了PVDF膜96孔板，然后分別優(yōu)化了捕獲抗體和檢測抗體的濃度、上板細胞數(shù)目及刺激物濃度。結(jié)果顯示，當捕獲抗體和檢測抗體的濃度分別為1:60、上板細胞數(shù)為2×105個/孔、刺激用病毒量為2×105TCID50時，獲得了較為穩(wěn)定的檢測體系。
　　 在建立豬I

7、L-2、IL-4、IL-10的實時定量RT-PCR檢測方法時，我們首先以五指山小型豬cDNA為模板，擴增了豬IL-2、IL-4、IL-10的基因保守區(qū)，將其分別克隆入T載體中，構(gòu)建了相應(yīng)的重組質(zhì)粒。然后將重組質(zhì)粒分別進行10倍梯度稀釋，將其作為質(zhì)粒標準品構(gòu)建了標準曲線。結(jié)果顯示，各標準曲線的直線相關(guān)系數(shù)｜r｜均大于0.990，且擴增效率在90％-105％之間。對該檢測方法進行了方法學(xué)評價，結(jié)果顯示，該檢測方法的敏感性較高，IL-4檢測下

8、限達到100copies/μL，IL-2、IL-10檢測下限達到102copies/μL；重復(fù)性較好，批內(nèi)重復(fù)性與批間重復(fù)性分析變異系數(shù)基本都小于5％。這些評價結(jié)果都進一步說明了我們所建立的定量RT-PCR檢測方法的可靠性。
　　 在建立豬細胞因子檢測方法的基礎(chǔ)上，我們對其進行了初步應(yīng)用。我們采用ELISPOT方法對PRRSV接種后第0、7、14、21天豬PBMC特異性分泌γ-干擾素情況進行了測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種后各豬IFN-γ

9、表達水平呈明顯上升趨勢，第21天時達到最高峰；未接種的各豬則表現(xiàn)出IFN-γ表達水平穩(wěn)定無上升趨勢。這說明豬感染高致病性PRRSV后PBMC分泌IFN-γ能力明顯增強，高致病性PRRSV可誘導(dǎo)豬體內(nèi)效應(yīng)T細胞發(fā)揮抗感染的作用。
　　 同時，我們還對攻毒后細胞中IL-2、IL-4及IL-10 mRNA的表達情況進行了分析。用建立的方法檢測高致病性PRRSV感染仔豬。Taqman熒光定量PCR檢測各樣品中IL-2、IL-4、IL-1

10、0細胞因子mRNA表達量，同時擴增β-actin作為內(nèi)參對照。采用雙標準曲線法進行相對定量，根據(jù)測得的Ct值與標準曲線得到樣品中對應(yīng)的IL-2、IL-4、IL-10基因拷貝數(shù)，以β-actin作內(nèi)參，分析各細胞因子mRNA的表達差異。結(jié)果顯示，攻毒后某些豬的各細胞因子水平變化較大，而對照組相對變化較小。下一步還需增加樣本數(shù)才可從中總結(jié)中變化規(guī)律。
　　 本研究將有助于病毒感染后豬體內(nèi)免疫應(yīng)答的研究，對于豬作為實驗動物的比較醫(yī)學(xué)研