lncRNA HOTAIR、MDA9蛋白及GRP78蛋白在惡性黑色素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中的研究.pdf

1、惡性黑色素瘤是一種惡性程度極高的皮膚腫瘤,是皮膚病中死亡率最高的疾病。侵襲和轉(zhuǎn)移是影響該疾病患者生存的首要因素,也是其治療的最大障礙。關(guān)于惡性黑色素瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不十分清楚。因此,有必要對(duì)其侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制進(jìn)行研究,進(jìn)而為臨床診斷、防治惡性黑色素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移提供分子水平的新型治療方法。
　　目的：
　　1、通過定量反轉(zhuǎn)錄PCR從6個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)中篩選出與惡性黑色素瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)性最大的lncRNA,研

2、究它與惡性黑色素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系,以期為惡性黑色素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的治療提供靶目標(biāo);
　　2、通過雙向電泳實(shí)驗(yàn)從3對(duì)原發(fā)黑色素瘤組織及對(duì)應(yīng)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中篩選出與惡性黑色素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白,以期發(fā)現(xiàn)它們影響惡性黑色素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制,為臨床診斷、防治惡性黑色素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移提供分子水平的新型治療方法。
　　方法：
　　1、從3對(duì)原發(fā)黑色素瘤組織及對(duì)應(yīng)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中提取出總 RNA,再用總RNA通過反轉(zhuǎn)錄

3、PCR從6個(gè)長(zhǎng)編碼RNA中選出與惡性黑色素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)性最大的lncRNA;
　　2、從3對(duì)原發(fā)黑色素瘤組織及對(duì)應(yīng)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中提取出總的蛋白質(zhì),通過雙向電泳實(shí)驗(yàn)篩選出與惡性黑色素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白,并從中挑選出在原發(fā)及轉(zhuǎn)移惡性黑色素瘤中表達(dá)差異明顯的并可能存在相互作用的兩種蛋白,再通過熒光定量PCR驗(yàn)證雙向電泳實(shí)驗(yàn)的結(jié)果;
　　3、通過分子克隆技術(shù)得到含編碼這兩種蛋白的基因的質(zhì)粒,并將克隆得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293

4、T細(xì)胞中通過western blotting檢測(cè)其蛋白的表達(dá);
　　4、將篩選出的lncRNA及這兩種蛋白的siRNA轉(zhuǎn)染至A375細(xì)胞中,并通過PCR驗(yàn)證siRNA的下調(diào)功能;
　　5、用轉(zhuǎn)染了篩選出的lncRNA及這兩種蛋白的siRNA及非靶目標(biāo) siRNA(siControl)的A375細(xì)胞通過基質(zhì)膠侵襲試驗(yàn)及劃痕試驗(yàn)驗(yàn)證該lncRNA及蛋白對(duì)黑色素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是否產(chǎn)生影響;
　　6、用轉(zhuǎn)染了該lncRNA的si

5、RNA及非靶目標(biāo)siRNA(siControl)的A375細(xì)胞通過原位酶譜試驗(yàn)驗(yàn)證該lncRNA對(duì)惡性黑色素瘤細(xì)胞的白明膠酶活性是否產(chǎn)生影響;
　　7、通過CO-IP試驗(yàn)驗(yàn)證這兩種蛋白之間是否存在相互作用;
　　8、如果這兩種蛋白之間存在相互作用,通過相關(guān)軟件推測(cè)這兩種蛋白相互作用的可能機(jī)制,并通過相應(yīng)的試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證這種作用機(jī)制對(duì)惡性黑色素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移起作用。
　　結(jié)果：
　　1、通過反轉(zhuǎn)錄PCR篩選出lncR

6、NA HOTAIR與惡性黑色素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān),并通過劃痕試驗(yàn)、侵襲試驗(yàn)以及原位酶譜試驗(yàn)充分證實(shí)了lncRNA HOTAR能促進(jìn)惡性黑色素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　2、通過雙向電泳實(shí)驗(yàn)篩選出MDA9及GRP78這兩種蛋白與惡性黑色素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān),并通過劃痕試驗(yàn)及侵襲試驗(yàn)證實(shí)了MDA9及GRP78這兩種蛋白能促進(jìn)惡性黑色素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移,但這兩種蛋白是否存在相互作用以及它們促進(jìn)惡性黑色素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　

7、　討論：
　　1、本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了lncRNA HOTAR能促進(jìn)惡性黑色素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移,盡管需要進(jìn)一步關(guān)于HOTAIR對(duì)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的影響機(jī)制的研究,但在該研究中所觀察到的HOTAIR轉(zhuǎn)移活性說明HOTAIR可能是治療惡性黑色素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的潛在靶目標(biāo)。
　　2、本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了MDA9及GRP78這兩種蛋白的表達(dá)能促進(jìn)惡性黑色素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移,但尚需進(jìn)一步的研究證明這兩種蛋白是否存在相互作用以及它們促進(jìn)惡性黑色素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的