木香烯內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯抑制膠質(zhì)瘤相關(guān)作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：兩種倍半萜烯內(nèi)酯，木香烯內(nèi)酯（Costunolide，CT）和去氫木香內(nèi)酯（Dehydrocostus lactone,DHE），在過去被用作為抗炎藥來治療多種疾病。最近幾年，因研究發(fā)現(xiàn)他們對(duì)多種惡性腫瘤均表現(xiàn)出良好的抗癌效果而引起廣泛關(guān)注。然而，它們能否對(duì)膠質(zhì)瘤產(chǎn)生作用及相關(guān)作用機(jī)制目前卻知之甚少。本課題旨在探討二者抗膠質(zhì)瘤的作用，以及潛在的作用機(jī)制。
　　方法：為了評(píng)估CT和DHE抗膠質(zhì)瘤的作用效果，我們用不同濃度的CT

2、和DHE（0，1，10，25，50和100μM）對(duì)三種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系（U118，U251和U87）分別處理12，24，36和48小時(shí)。然后采用MTT實(shí)驗(yàn)去檢測(cè)細(xì)胞活力。接下來，我們應(yīng)用克隆形成實(shí)驗(yàn)去檢驗(yàn)CT和DHE對(duì)U87和U251細(xì)胞克隆形成能力的影響。隨后，我們?cè)跓o血清的情況下進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，來檢驗(yàn)CT和DHE對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系遷移能力的影響。激光共聚焦免疫熒光實(shí)驗(yàn)被用來檢測(cè)經(jīng)DHE處理的U87細(xì)胞，是否會(huì)造成細(xì)胞色素C從線粒體

3、釋放到胞漿中。然后，我們應(yīng)用western blot的方法進(jìn)一步檢測(cè)在DHE處理U87細(xì)胞的過程中，從線粒體釋放到胞漿中的細(xì)胞色素C的量。為了更好的探討DHE誘導(dǎo)U87細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，我們通過western blot的方法對(duì)線粒體介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路中的幾個(gè)凋亡相關(guān)蛋白予以檢測(cè)。后來，我們應(yīng)用western blot實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)三種人源膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系（U118，U251和U87）中的COX-2蛋白表達(dá)情況予以檢測(cè)，來比較三者之間的

4、相對(duì)表達(dá)量的高低。之后，我們以U87和U251細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，檢測(cè)DHE抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生長(zhǎng)的作用是否與COX-2相關(guān)。然后，分別用western blot和RT-PCR的方法在蛋白和mRNA水平對(duì)COX-2的表達(dá)予以檢測(cè)。為了明確DHE對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87細(xì)胞的COX-2 mRNA的表達(dá)水平的抑制效應(yīng)是否是通過影響p300和p65/p50 NF-κB與COX-2啟動(dòng)子的結(jié)合實(shí)現(xiàn)的，我們將經(jīng)DHE（未）處理過的U87細(xì)胞通過染色質(zhì)免疫

5、共沉淀（chromatin immunoprecipitation assay,ChIP）實(shí)驗(yàn)予以檢測(cè)分析。為了進(jìn)一步明確DHE是否影響p300和p65/p50 NF-κB與COX-2啟動(dòng)子的結(jié)合活性，我們采用鏈霉親和素-瓊脂糖pull down實(shí)驗(yàn)對(duì)其予以檢測(cè)。該實(shí)驗(yàn)的大致情況是，向經(jīng)DHE（未）處理過的U87細(xì)胞的核蛋白提取液中加入生物素化的COX-2啟動(dòng)子區(qū)探針和鏈霉親和素-瓊脂糖小球。孵育后離心，然后，與 COX-2結(jié)合的p30

6、0和p65/p50NF-κB以復(fù)合體的形式被沉淀下來，隨后執(zhí)行western blot實(shí)驗(yàn)予以分析。其后，我們對(duì)經(jīng)DHE（未）處理過的U87細(xì)胞核蛋白提取液中總的p300和p65/p50 NF-κB的蛋白量予以檢測(cè)分析。為了進(jìn)一步證實(shí)DHE抑制p300的募集和p65/p50 NF-κB蛋白的核轉(zhuǎn)位和它們之間的相互作用，我們采用免疫熒光染色，檢測(cè) p300和 p65/p50 NF-κB在 U87細(xì)胞中的定位和分布。為了充分明確DHE對(duì)膠質(zhì)

7、母細(xì)胞瘤作用的相關(guān)分子機(jī)制，我們接下來調(diào)查DHE對(duì)U87和U251細(xì)胞中IKKβ/ IκBα/NF-κB信號(hào)通路的影響，采用western blot方法對(duì)p-IKKα/β、IKKα、IKKβ、p-IκBα、IκBα、p-p65和 p65蛋白的表達(dá)水平予以檢測(cè)。此后，我們?cè)O(shè)想IKKβ可能是DHE作用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞的一個(gè)靶點(diǎn)。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們應(yīng)用分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)來模擬DHE和IKKβ之間的相互作用。為了檢測(cè)DHE是否可以通過血腦屏障，我們給

8、每只SpragueDawley（SD）大鼠以100 mg/kg的劑量注射 DHE。一小時(shí)后，我們采用立體定位的方式從大鼠的小腦延髓池抽取腦脊液（Cerebro-Spinal Fluid，CSF）。然后，利用乙腈對(duì)CSF中的DHE進(jìn)行萃取，隨后用質(zhì)譜進(jìn)行分析。然后，我們建立裸鼠種植瘤模型來進(jìn)一步檢驗(yàn)DHE在體內(nèi)抑制膠質(zhì)瘤的作用情況。為了監(jiān)測(cè)DHE的毒性，每?jī)商煊涗浡闶篌w重；為了監(jiān)測(cè)DHE的抑瘤效果，每隔一天記錄腫瘤的大小。所有裸鼠在種瘤3

9、0天后處死，隨后將腫瘤完整取出稱重，然后放入10%福爾馬林中固定。此外，為了進(jìn)一步探索DHE在體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)的潛在作用機(jī)制，我們應(yīng)用免疫組化實(shí)驗(yàn)對(duì)種植瘤中 COX-2、p-p65和p-IKKβ的水平予以檢測(cè)。
　　結(jié)果：將三種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（U118、U251和U87）細(xì)胞系用不同濃度的CT和DHE處理不同時(shí)間后，應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞活力予以檢測(cè)。我們發(fā)現(xiàn)CT和DHE都可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，且呈劑量和時(shí)間的依賴性。經(jīng)CT處理48

10、小時(shí)后，CT對(duì) U118、U251和 U87三種細(xì)胞作用的IC50值分別是25.24±1.15、34.45±2.8和40.18±3.21μM；而DHE對(duì)U118、U251和U87三種細(xì)胞作用的IC50值分別是17.16±2.11、22.33±1.93和26.42±2.84μM。然后，應(yīng)用克隆形成實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞克隆形成能力予以評(píng)估。我們發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，CT和 DHE均可以顯著抑制克隆形成的數(shù)量，并呈現(xiàn)劑量依賴性。再應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞的遷移能

11、力予以評(píng)估。我們發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，CT和 DHE可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞的遷移率。此后，應(yīng)用激光共聚焦免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DHE是否可以引起U87細(xì)胞中的細(xì)胞色素C從線粒體中釋放。在對(duì)照組，細(xì)胞色素C主要存在于線粒體中，然而，隨著DHE濃度的增加，綠色熒光開始彌散，表明胞漿中細(xì)胞色素 C水平逐漸升高。然后，我們對(duì)線粒體凋亡通路的相關(guān)蛋白予以檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)DHE可以顯著增加胞漿中細(xì)胞色素C的蛋白水平，以及cleaved caspase3/9蛋白的水平

12、，并且下調(diào)Bcl-2蛋白的水平和Bcl-2/BAX的比率。然后，我們應(yīng)用western blot方法對(duì)U118、U251和U87細(xì)胞中的COX-2蛋白表達(dá)水平予以檢測(cè)，結(jié)果表明，U87和U251細(xì)胞中COX-2蛋白表達(dá)量明顯高于U118細(xì)胞。因此，我們選用U87和U251兩種細(xì)胞系去驗(yàn)證DHE對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)是否與影響COX-2的表達(dá)相關(guān)。Western blot和RT-PCR的結(jié)果表明在蛋白和mRNA水平DHE都可以有效的抑

13、制COX-2的表達(dá)，并呈現(xiàn)劑量依賴性。接下來，我們通過ChIP實(shí)驗(yàn)和鏈霉親和素-瓊脂糖pull down實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證，是否p300和p65/p50 NF-κB參與了DHE對(duì)COX-2的調(diào)節(jié)過程。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，DHE可以顯著抑制p300的募集和p65/p50 NF-κB與COX-2啟動(dòng)子的結(jié)合。隨后，western blot結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，經(jīng)DHE處理后，胞核中p300和p65/p50 NF-κB的蛋白量顯著減少。然后，我

14、們通過激光共聚焦免疫熒光染色來觀察U87細(xì)胞中p300和p65/p50 NF-κB的定位和分布情況。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，經(jīng)DHE處理后，p300和p65/p50 NF-κB在胞核中的量明顯減少，而在胞漿中的量相對(duì)增多。因此，為了充分明確DHE對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤作用的相關(guān)分子機(jī)制，我們接下來檢測(cè)DHE對(duì)U87和U251細(xì)胞中IKKβ/ IκBα/NF-κB信號(hào)通路的影響。Western blot結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，經(jīng)DHE處理后，p-

15、IKKα/β、p-IκBα和 p-p65蛋白的水平顯著下調(diào)，且呈劑量依賴性。然而，IKKα、IKKβ、IκBα和NF-κB p65的蛋白表達(dá)水平基本不變。這說明DHE可能是通過抑制IKKβ的活性而抑制NF-κB的激活。然后，行分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)表明，DHE可以與IKKβ的ATP結(jié)合位點(diǎn)相互結(jié)合。這些結(jié)果表明，DHE是通過作用于IKKβ靶點(diǎn)來抑制NF-κB信號(hào)通路，從而抑制COX-2的表達(dá)的。在體內(nèi)研究中，將CSF樣本通過質(zhì)譜檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，在1

16、.81 mins出現(xiàn)一個(gè)單峰。表明在大鼠模型中，DHE可以迅速通過血腦屏障。因此，我們建立裸鼠種植瘤模型進(jìn)一步探討DHE在體內(nèi)抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生長(zhǎng)的作用。在DHE處理過程中，裸鼠體重未發(fā)生明顯變化，然而，與對(duì)照組相比，處理組的腫瘤體積和重量均明顯減小。所以，這些結(jié)果表明，DHE在體內(nèi)模型中也能夠很好的發(fā)揮抗膠質(zhì)瘤作用。接下來，免疫組化結(jié)果表明DHE可以抑制IKKβ/NF-κB/COX-2通路的激活，這可能是DHE抑制種植瘤生長(zhǎng)的機(jī)制之一

17、。
　　結(jié)論：本研究旨在探討CT和DHE抗膠質(zhì)瘤的特性及其潛在的作用機(jī)制。研究表明CT和DHE均可以顯著抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞活力、增殖能力和遷移能力。同時(shí)，DHE還可以通過促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，激活caspase信號(hào)級(jí)聯(lián)，從而誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。此外，本研究證實(shí)DHE可以通過靶向IKKβ激酶的ATP結(jié)合位點(diǎn)，抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，從而抑制p300和NF-κB對(duì)COX-2基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)。另外，本研究首次證實(shí)DHE可以