miR-155在冠心病患者中的表達(dá)及對小鼠巨噬細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、研究背景及目的:動脈粥樣硬化性心血管疾病是全球發(fā)病率和死亡率居首位的疾病。大量的證據(jù)表明炎癥和免疫反應(yīng)在動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的發(fā)生發(fā)展中有舉足輕重的作用，從脂紋的形成到最終急性冠脈綜合征(acutecoronarysyndromes，ACS)的發(fā)生。小分子RNA(MicroRNAs，miRNAs)已被證明參與炎癥和免疫反應(yīng)。miRNAs是長度為18-22個核苷酸的非編碼RNA分子，通過抑制蛋白翻譯或引起m

2、RNA降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。在眾多的miRNA，炎癥相關(guān)的miRNAmicroRNA-155(miR-155)已被發(fā)現(xiàn)參與動脈粥樣硬化。
　　目前認(rèn)為AS為體內(nèi)外多種因素綜合作用的結(jié)果，凋亡的增加為其中的因素之一，而凋亡增加確切的分子機制尚不明確。巨噬細(xì)胞凋亡已被證實為進(jìn)展期動脈粥樣硬化斑塊的一個突出特點。進(jìn)展期動脈粥樣硬化病變的大量病理研究提示:巨噬細(xì)胞凋亡和大的壞死核心密切相關(guān)，并最終促進(jìn)斑塊破裂和急性血管事件

3、。氧化型低密度脂蛋白(Oxidizedlow-densitylipoprotein，OxLDL)是一個重要的動脈粥樣硬化致病因子，也是一個潛在的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。以前的研究已經(jīng)表明，OxLDL誘導(dǎo)了多種組織和細(xì)胞的凋亡，包括內(nèi)皮細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。一個由死亡受體家族，主要涉及Fas/FasL的信號和下游的caspase-3，介導(dǎo)的外源性凋亡途徑，已被認(rèn)為是OxLDL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的機制之一。由于巨噬細(xì)胞凋亡在動脈粥樣硬化和斑塊不穩(wěn)

4、定中起著重要作用，細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)可對進(jìn)展期動脈粥樣硬化斑塊破裂提供顯著的保護。越來越多的證據(jù)表明，細(xì)胞凋亡可由miRNA調(diào)控。作為一個多功能的miRNA，miR-155被證實參與免疫反應(yīng)和細(xì)胞凋亡通路的調(diào)節(jié)。
　　miR-155和動脈粥樣硬化疾病的進(jìn)展之間的關(guān)系目前還不清楚。這項研究首先旨在研究miR-155與冠狀動脈狹窄病變的嚴(yán)重程度及斑塊穩(wěn)定性的關(guān)系。此外，鑒于其在凋亡途徑中的重要作用，我們推測miR-155在OxLDL誘導(dǎo)的

5、巨噬細(xì)胞凋亡中扮演重要角色。因此，本研究的主要目的是為了證明miR-155在OxLDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡中的作用及其具體機制。
　　研究方法:(1)我們收集了110例疑似冠心病(coronaryheartdisease，CHD)患者，行冠狀動脈CTA及冠狀動脈造影檢查冠脈病變情況，根據(jù)冠狀動脈造影結(jié)果進(jìn)行Gensini評分，評估冠狀動脈狹窄病變的嚴(yán)重程度和范圍;根據(jù)冠狀動脈CTA評估斑塊穩(wěn)定性。采用實時定量PCR方法檢測了新鮮分離

6、的外周血單個核細(xì)胞(peripheralbloodmonouclearcell，PBMCs)和血漿中miR-155的表達(dá)。(2)用不同濃度及時間梯度的OxLDL處理RAW264.7細(xì)胞，采用實時定量PCR方法檢測miR-155的表達(dá)水平。(3)miR-155的模擬物，miR-155的抑制劑和陰性對照被瞬時轉(zhuǎn)染入RAW264.7細(xì)胞或HEK-293細(xì)胞以實現(xiàn)miR-155的表達(dá)水平的上調(diào)或下調(diào)?；騀ADD表達(dá)載體被用來感染RAW264.7

7、細(xì)胞以實現(xiàn)FADD表達(dá)水平的上調(diào)。(4)我們采用細(xì)胞活力實驗(細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8)檢測oxLDL處理過的RAW264.7細(xì)胞的活力。(5)采用TUNEL法、雙染色流式法(AnnexinV/PI)和caspase-3的活化片段(17kDa)的蛋白表達(dá)等方法評估巨噬細(xì)胞凋亡。(6)采用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測miR-155的潛在靶標(biāo)。(7)采用熒光素酶實驗來驗證假定的miR-155靶標(biāo)。(8)免疫印跡法(WB)用于檢測caspase-3和FADD

8、的蛋白表達(dá)水平。
　　研究結(jié)果:(1)56例冠心病患者PBMCs及血漿中miR-155的表達(dá)水平明顯低于54例非冠心病患者(P＜0.01)。(2)不穩(wěn)定性心絞痛組(unstableanginapectoris，UAP,n=31)和急性心梗組(acutemyocardialinfarction，AMI，n=24)患者PBMCs及血漿中miR-155的水平明顯低于胸痛綜合征組(chestpainsyndrome，CPS，n=31)組，

9、而穩(wěn)定性心絞痛組(stableanginapectoris，SAP，n=24)和CPS組患者之間無統(tǒng)計學(xué)差異。(3)Spearman相關(guān)分析表明，血漿中miR-155的表達(dá)水平與PBMCs中miR-155的表達(dá)水平呈正相關(guān)。(4)有2支或大于等于3支病變血管患者的miR-155水平明顯低于0和1支病變血管的患者。0支和1支病變血管的患者之間miR-155的水平?jīng)]有顯著差異。(5)miR-155水平與Gensini積分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.

10、663，P＜0.001)。(6)軟斑塊組miR-155的表達(dá)水平較纖維斑塊組及鈣化斑塊組降低(P＜0.05)。(7)miR-155的表達(dá)水平與年齡(r=-0.227)、高血壓(R=-0.440)、總膽固醇(R=0.239)、高密度脂蛋白(HDL)膽固醇(R=0.280)、低密度脂蛋白(LDL)膽固醇(r=-0.315)、吸煙(R=-0.363)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(R=-0.250)、他汀類藥物(r=-0.368)，高敏C-反應(yīng)蛋白

11、(hs-CRP)(r=-0.515)等相關(guān)。(8)OxLDL以劑量和時間依賴方式增加RAW264.7細(xì)胞中miR-155的表達(dá)。(9)OxLDL能顯著增加RAW264.7細(xì)胞凋亡，miR-155模擬物能抑制此作用，而miR-155的拮抗劑能抵消miR-155的抗凋亡作用。(10)生物信息學(xué)分析顯示FADD可能為miR-155的直接靶標(biāo)。(11)螢光素酶報告基因檢測和WB實驗進(jìn)一步證實miR-155直接通過作用于FADD的3'-UTR區(qū)域

12、從而抑制FADD表達(dá)。(12)miR-155抑制oxLDL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，但FADD過表達(dá)限制了miR-155的抗凋亡活性。
　　研究結(jié)論:miR-155的表達(dá)水平與復(fù)雜的致動脈粥樣硬化的代謝危險因素、冠狀動脈狹窄病變的嚴(yán)重程度（由Gensini積分評估）、斑塊穩(wěn)定性（由冠脈CTA評估）呈負(fù)相關(guān)，提示miR-155在動脈粥樣硬化進(jìn)展中起保護作用。此外，我們的研究結(jié)果表明，miR-155通過作用于其靶標(biāo)FADD，抑制oxLDL誘導(dǎo)的