百合無癥病毒在百合葉綠體中的檢測.pdf

1、一般認(rèn)為，在植物病毒侵染宿主植株以后，主要是通過破壞細(xì)胞葉綠體結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響葉綠素的積累和光合作用。本課題組前期的實(shí)驗(yàn)表明，百合無癥病毒(Lily SymptomlessVirus，LSV)單獨(dú)感染百合植株外部癥狀不明顯，且宿主植物生理指標(biāo)、光合作用、葉綠體超微結(jié)構(gòu)等受影響程度與百合斑駁病毒(Lily mottle virus，LMoV)感染相比危害較輕，為了證明LSV是否存在于葉綠體中，本研究通過對(duì)感染LSV的植株進(jìn)行葉綠體提取、葉綠體

2、總蛋白的提純以及外殼蛋白(Coat Protein，CP)在葉綠體積累的分子檢測三方面研究，以期弄清LSV的作用位點(diǎn)，進(jìn)一步闡明LSV的致病機(jī)理。
　　本研究分別以感染LSV和健康對(duì)照的東方百合“索邦”(Lilium oriental，'Sorbonne')的葉片為材料。LSV粒子的分離純化首先采用PEG沉淀法粗提，然后采用蔗糖密度梯度離心法進(jìn)一步分離純化。通過電鏡觀察以及酶標(biāo)儀分析，發(fā)現(xiàn)采用PEG沉淀法粗提病毒粒子濃度較低且雜質(zhì)

3、很多，而采用蔗糖密度梯度離心提純法進(jìn)一步提純后，得到的LSV粒子濃度較高且雜質(zhì)較少。LSV提純粒子的OD260/OD280為1.331，符合純品標(biāo)準(zhǔn)。所得LSV提純粒子的濃度為0.328 mg/mL，產(chǎn)量為鮮重每克葉片可提純病毒粒子14.53μg。
　　采用緩沖液抽提法和酶解法分別提取葉綠體，并對(duì)各自反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。緩沖液抽提法的優(yōu)化方案如下:在抽提緩沖液中加入5％山梨醇，2500r/min蔗糖密度梯度離心獲得的葉綠體產(chǎn)量最高，

4、鮮重每克葉片完整葉綠體的葉綠素提取量為130.4mg。酶解法的優(yōu)化方案如下:4℃低溫處理百合葉片24h，向CPW鹽溶液中加入0.5％果膠酶、20mmol/L MES、0.6mol/L甘露醇和1％纖維素酶酶解5h，得到葉綠體產(chǎn)量最高，鮮重每克葉片完整葉綠體的葉綠素提取量為182.7mg。將兩種優(yōu)化的方案結(jié)合起來，形成一套綜合提取方案，以此種方法進(jìn)行葉綠體提取，鮮重每克葉片完整葉綠體的葉綠素提取量為191.1mg。因此，綜合法是提取百合完整