百合無癥病毒的RT-PCR和核酸雜交檢測及其外殼蛋白在大腸桿菌中的表達.pdf

1、　 百合無癥病毒是危害百合的重要病毒，在世界各地均有分布，是我國禁止進境的潛在危險性有害植物病毒。該病毒病的發(fā)生日益嚴重，給百合種植業(yè)造成極大的經(jīng)濟損失。目前我國植物病毒檢驗檢疫工作和脫毒檢測的大量應用還是在血清學檢測上，特別是ELISA檢測。但百合無癥病毒難以提純作為抗原，抗血清的生產(chǎn)沒有完全達到商品化，檢測基本依賴外國進口試劑盒。分子生物學檢測方法靈敏度高，有很高的實際應用價值。為此，本研究開展百合無癥病毒的分子生物學檢測方法及外殼

2、蛋白原核表達的研究，為其檢驗檢疫提供方法標準，并為抗血清的制備提供蛋白融合表達抗原材料。 對百合病株檢測表明，直接法，間接法，雙抗夾心法，斑點酶聯(lián)四種血清學檢測限度依次為：靈敏度320μg，160μg，80μg，160μg病葉。植株脫毒苗的檢出率分別為30﹪，35﹪，45﹪，55﹪。根據(jù)百合無癥病毒核酸序列設計一對特異性引物，對提取百合葉片中總RNA進行反轉(zhuǎn)錄擴增，得到412bp的目的片段，建立百合無癥病毒的RT-PCR檢測方法

3、。將此片段克隆到pUCm-T載體上，酶切后回收目的片段。用隨機引物法地高辛標記合成cDNA探針，進行核酸斑點雜交檢測。RT-PCR和核酸雜交檢測百合病葉總RNA的稀釋限度分別為1：10-6和1：10-2。檢測方法快速，靈敏。 應用RT-PCR方法從感病百合總RNA中擴增出百合無癥病毒的外殼蛋白基因片段，連接到原核載體pUC19，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并用IPTG誘導表達。SDS-PAGE及Westernblot分析表明：外殼蛋白基因