線蟲生防菌黑曲霉抗藥性菌株ANUV90研究.pdf

1、黑曲霉(Aspergillus niger)為本研究室篩選獲得具有獨(dú)立知識(shí)產(chǎn)權(quán)的優(yōu)良線蟲生防菌株，其代謝產(chǎn)物對(duì)植物寄生線蟲具有很強(qiáng)韻毒殺能力。本論文針對(duì)植物寄生線蟲生物防治中存在的問題，如微生物生防菌劑與化學(xué)農(nóng)藥兼容性差、生防菌回收檢測(cè)難等，以黑曲霉為原始出發(fā)菌株，以番茄根結(jié)線蟲為靶標(biāo)，篩選獲得對(duì)根結(jié)線蟲具高殺線活性的黑曲霉抗藥性菌株，并對(duì)其原始野生型菌株與誘變的抗藥性菌株在耐藥濃度、抗藥性的穩(wěn)定遺傳、生物學(xué)特性、常見化學(xué)藥劑的兼容性、

2、分子水平、定殖回收檢測(cè)數(shù)量差異等方面進(jìn)行了深入研究。具體結(jié)果如下： 1．通過紫外誘變結(jié)合化學(xué)藥劑定向誘導(dǎo)獲得遺傳穩(wěn)定的、對(duì)線蟲有高毒力的黑曲霉抗藥性菌株--ANUV90。應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室分離獲得的對(duì)線蟲高毒力的黑曲霉菌株(AN)，測(cè)定AN菌株對(duì)多菌靈(MBC類藥劑)的EC<,50>為0.668μg/mL，證實(shí)AN菌株對(duì)多菌靈極為敏感，通過紫外誘變結(jié)合藥劑馴化定向誘導(dǎo)，獲得對(duì)MBC類藥劑高抗的菌株ANUV90，其抗藥濃度遠(yuǎn)大于1500

3、μg/mL(這一濃度遠(yuǎn)大于多菌靈田間施用濃度)，與原始菌株抗藥濃度相比，提高了1000多倍。ANUV90菌株水溶性組分在12h、24h和48h對(duì)線蟲相對(duì)致死率與原始菌株相比無明顯差異。 2．通過常規(guī)方法測(cè)定，ANUV90菌株的生物學(xué)特性與原菌株黑曲霉無明顯差別。結(jié)果表明： (1)該菌株在PSA、基本、查氏和孟加拉紅培養(yǎng)基上，在25℃條件下均能生長(zhǎng)，其中在PSA培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)最快，在孟加拉紅培養(yǎng)基上菌落直徑最小。pH對(duì)菌

4、絲生長(zhǎng)影響不大，最適宜pH范圍為5.5-8.5。光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)有一定作用，光照條件下茵絲生長(zhǎng)較黑暗條件下快。菌絲生長(zhǎng)對(duì)碳、氮源選擇作用不明顯，葡萄糖為最佳碳源；NaNO<,3>、酵母浸出汁、牛肉浸膏比其它氮源更有利于菌絲生長(zhǎng)和孢子產(chǎn)生。 (2)采用懸滴凹玻片法測(cè)定黑曲霉抗藥性突變菌株孢子萌發(fā)的最適條件，其中最適pH為2，最適碳源為麥芽糖和D-果糖，最適氮源為蛋白胨和L-天門冬酰胺，而光照對(duì)孢子萌發(fā)的作用不明顯。 3．AN

5、UV90菌株與大多數(shù)化學(xué)藥劑兼容性良好，MBC類藥劑與氨基甲酸酯類藥劑之間存在的負(fù)交互抗藥性在本項(xiàng)試驗(yàn)得到驗(yàn)證。除乙霉威(氨基甲酸酯類農(nóng)藥)外，ANUV90與多數(shù)常用農(nóng)藥可協(xié)同混配使用防治多種有害生物，而對(duì)低濃度(EC<,50><0.1μg/mL)乙霉威高度敏感，表明ANUV90對(duì)MBC類藥劑的高度抗性穩(wěn)定，因?yàn)镸BC類藥劑與乙霉威存在穩(wěn)定的負(fù)交互抗藥性。 4．初步對(duì)ANuV90進(jìn)行抗藥性分子檢測(cè)研究。通過采用特異性引物B1、B

6、3，在AN與ANUV90菌株的總基因組中成功擴(kuò)增得到編碼β-微管蛋白基因，兩菌株該序列大小均為854bp，通過Blast比對(duì)分析表明AN與ANUV90的β-微管蛋白基因片段與NCBI數(shù)據(jù)庫中的一些真菌的β-微管蛋白基因序列相似，其中與和黑曲霉為同一屬的典型模式真菌Aspergillus nidulans(benA)的β-微管蛋基因序列比對(duì)核苷酸同源性為92.3％。該序列共編碼203個(gè)氨基酸，并進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)分析，與AN菌株相比，AN

7、UV90的β-微管蛋基因核苷酸在84位發(fā)生了變異，導(dǎo)致氨基酸發(fā)生了變化，28位谷氨酸(Glu)替換成天冬氨酸(Asp)，可能導(dǎo)致ANUV90在生物學(xué)特性上產(chǎn)生抗藥性。 5．利用ANUV90獲得的抗藥性標(biāo)記研究黑曲霉在土壤中的存活、定殖規(guī)律。結(jié)果表明，ANUV90對(duì)番茄幼苗生長(zhǎng)無影響，可以在番茄根際、根表定殖，但不能在番茄體內(nèi)生存。處理ⅡANUV90可在根際有效定殖，在接種后16-24天菌量達(dá)到峰值，并基本保持了8天左右，以后逐漸

8、下降，第32天仍然維持在原始接種量以上水平；處理Ⅳ的ANUV90菌株在土壤中繁殖速度較之處理Ⅱ則稍快一些，在12-20天菌量達(dá)到高峰區(qū)段，在接種后第16天達(dá)到菌量峰值，而其種群宏觀變化趨勢(shì)與處理Ⅱ基本相同。 本論文明確了黑曲霉原始菌株與抗藥性菌株對(duì)多菌靈的抗性差異。黑曲霉抗藥性菌株ANUV90遺傳了原始野生型菌株AN的水溶性組分對(duì)線蟲有高致病力、對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件要求粗放等生物學(xué)特性，除可與MBC類藥劑可發(fā)生負(fù)交互抗藥性的乙霉威外，和大