蛻皮甾酮對沙土鼠短暫前腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護作用和機制研究.pdf

1、前言
　　蛻皮甾酮（ecdysterone，簡寫EDS），是蛻皮類固醇的一種常見衍生物。除了對無脊椎動物有激素作用外，它對哺乳動物也表現(xiàn)出良好的非激素的生物學作用，例如加強局灶缺血損傷大鼠的血管生成、對地西泮和乙醇所致小鼠記憶障礙的保護作用。本文的目的是探討EDS是否對短暫前腦缺血再灌注損傷(transientglobalforebrainischemia/reperfusion)的沙土鼠有神經(jīng)保護作用及其作用機制。
　　短

2、暫前腦缺血再灌注損傷是由雙側頸總動脈夾閉術(BCCAO)造成的，予以同時夾閉雙側頸總動脈5分鐘，隨即再灌注并持續(xù)7天。EDS在沙土鼠腦缺血再灌注后立即腹腔注射，并且在接下來的7天存活時間里每天給藥1次。
　　在腦缺血再灌注后第7天，通過神經(jīng)功能缺損評分和Morris水迷宮實驗評價EDS是否對腦缺血再灌注損傷的沙土鼠具有提高學習及記憶能力的作用。并且通過沙土鼠頸總動脈夾閉處血管HE染色觀察，是否BCCAO對血管造成損傷引起血管狹窄或

3、閉塞，導致實驗誤差。通過Nissl染色和神經(jīng)元核心抗原(neuron-specificprotein/neuronalnuclei，簡寫NeuN)免疫組化染色實驗結果進行沙土鼠海馬CA1區(qū)各組間對比有活性神經(jīng)元的數(shù)量變化。進一步通過免疫組織化學染色分析海馬CA1區(qū)星形膠質細胞標志物膠質纖維酸性蛋白（GlialFibrillaryAcidicProtein，簡寫GFAP）陽性細胞和小膠質細胞標志物小膠質細胞/巨噬細胞特異性蛋白抗體（ion

4、izedcalciumbindingadaptermolecule-1，簡寫Iba-1）陽性細胞的數(shù)量。以此觀察沙土鼠短暫前腦缺血-再灌注損傷后海馬CA1區(qū)星形膠質細胞和小膠質細胞活化的情況，以及EDS治療后對其的影響。以激光共聚焦免疫熒光染色實驗觀察GFAP和腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor-α，簡寫TNF-α)的定位關系。進一步觀察EDS治療后TNF-α的變化情況，觀察是否EDS治療后可以通過影響星形膠質細胞

5、活化情況的變化，從而引起TNF-α這種炎性細胞因子釋放的變化。通過進一步的蛋白印跡法實驗(WesternBlot)檢驗腦缺血再灌注是否引起Caspase-3(cysteineasparticacidspecificprotease-3)表達的變化及EDS治療對其的影響。
　　本研究中，我們通過BCCAO法造成沙土鼠短暫前腦缺血-再灌注損傷模型，通過行為學和形態(tài)學及分子水平實驗手段觀察:(1)EDS是否對短暫前腦缺血-再灌注損傷沙土

6、鼠具有減少神經(jīng)功能缺損和提高其學習記憶能力的神經(jīng)保護作用;(2)EDS對對短暫前腦缺血-再灌注損傷沙土鼠的神經(jīng)保護機制是否通過其抑制海馬CA1區(qū)小膠質細胞和星形膠質細胞活化，從而減少TNF-α等炎性因子的釋放，導致Caspase-3活化水平的降低，最終通過減少神經(jīng)元的凋亡而實現(xiàn)的。
　　材料與方法
　　40只3月齡健康雄性蒙古沙土鼠，重量在80±10g，隨機均分為4組:(1)假手術組(n=10):常規(guī)BCCAO操作至分離出雙

7、側頸總動脈但并不夾閉，5分鐘后縫合;(2)溶劑對照組(n=10):BCCAO法造模后每日腹腔注射溶劑;(3)EDS低劑量組(n=10):造模后每日腹腔注射低劑量EDS溶劑;(4)EDS高劑量組(n=10):造模后每日腹腔注射高劑量EDS溶劑。溶劑對照組和EDS高低劑量組應用BCCAO法造成沙土鼠短暫前腦缺血再灌注損傷模型。造模后第2天開始進行Morris水迷宮訓練。造模第7天進行神經(jīng)功能缺損評分和Morris水迷宮實驗后，斷頭處死動物取

8、材，半腦固定半腦凍藏，同時留取頸總動脈夾閉段固定。制備沙土鼠半腦和頸總動脈冰凍切片。頸總動脈進行HE染色。半腦切片進行Nissl染色、TUNEL染色，以及NeuN、GFAP、Iba-1、TNF-α免疫組織化學染色和TNF-α與GFAP雙重免疫熒光標記的共聚焦實驗。凍藏海馬區(qū)腦組織行Caspase-3的WesternBlot實驗。應用細胞計數(shù)統(tǒng)計方法統(tǒng)計切片免疫組化染色結果。采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件作數(shù)據(jù)處理分析。神經(jīng)功能缺損評分應用

9、多組間均數(shù)比較的非參數(shù)KruskaWalli檢驗。Morris水迷宮結果和其他組化結果數(shù)據(jù)各組計量資料均以均數(shù)加減標準差表示，多因素重復測量方差分析比較各組之間指標變化，組間對比應用t檢驗分析，P＜0.01認為有顯著性差異。
　　實驗結果
　　1、頸總動脈HE染色結果
　　夾閉處頸總動脈管壁各層無損傷，未發(fā)現(xiàn)血管狹窄或血栓形成?？梢耘懦捎陬i總動脈夾閉造成損傷而導致血管狹窄或閉塞，引起永久性缺血，而導致實驗誤差的可能。

10、
　　2、行為學——神經(jīng)功能缺損評分和Morris水迷宮
　　EDS高低劑量治療組相比溶劑對照組，都明顯降低了神經(jīng)功能缺損分數(shù)。
　　在造模后第2天和第3天的可視平臺實驗中，假手術組、高劑量組、低劑量組和溶劑對照組沙土鼠的平均逃避潛伏期及搜索的平均路程呈逐漸下降趨勢。在造模后第5天到第7天的隱蔽平臺實驗中，各組沙土鼠搜索平臺的潛伏期及找到平臺所經(jīng)過的路程隨游泳次數(shù)增多呈下降趨勢。統(tǒng)計結果顯示，溶劑對照組沙土鼠搜索平臺潛

11、伏期及找到平臺所經(jīng)過路程與假手術組沙土鼠相比，二者均明顯延長，具有顯著的統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，而高低治療組的搜索平臺的潛伏期及找到平臺所經(jīng)過的路程則明顯低于溶劑對照組沙土鼠，有統(tǒng)計學意義。在空間探索實驗中，60s內對溶劑照組沙土鼠經(jīng)過相應平臺位置的次數(shù)明顯低于假手術組，而EDS高低劑量治療組沙土鼠則高于溶劑對照組。
　　3、Nissl染色結果
　　與假手術組對比，溶劑對照組海馬CA1區(qū)有活性神經(jīng)元數(shù)目顯著減少。相反，與

12、溶劑對照組相比，EDS高劑量治療組(50mg/kg)顯著緩解腦缺血損傷引起的尼氏染色陽性細胞的缺失(P＜0.01)。
　　4、NeuN免疫組織化學染色結果
　　NeuN免疫組織化學染色結果與尼氏染色的結果基本一致。與溶劑組相比，EDS治療組能顯著增加NeuN免疫組化陽性細胞的數(shù)量。
　　5、TUNEL染色結果
　　假手術組沙土鼠在海馬CA1區(qū)僅見少量TUNEL陽性反應細胞;短暫前腦缺血-再灌注7dayEDS治療組

13、沙土鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞內呈深棕色的TUNEL陽性細胞數(shù)目明顯較溶劑對照組減少。溶劑對照組海馬CA1區(qū)TUNEL陽性細胞數(shù)與EDS治療組之間比較有顯著性差異(P＜0.01)。
　　6、GFAP和Iba-1免疫組織化學染色結果
　　腦缺血后，沙土鼠海馬CA1區(qū)GFAP和Iba-1免疫組織化學陽性細胞顯著增多，而EDS治療后，卻相應減少。
　　7、TNF-α免疫組織化學染色結果
　　溶劑對照組TNF-α免疫組織化學

14、陽性細胞的數(shù)量較假手術組顯著增加，應用EDS治療后可以明顯減少。
　　8、激光共聚焦染色結果
　　雙重免疫熒光標記顯示TNF-α免疫陽性細胞同時對抗GFAP抗體呈陽性反應。
　　9、Westernblot檢測Caspase-3蛋白表達結果
　　應用EDS治療后有活性的Caspase-3表達水平較溶劑對照組顯著下降。
　　討論
　　在本研究中，通過BCCAO法造成沙土鼠短暫前腦缺血-再灌注損傷模型，應用

15、EDS治療后與溶劑對照組比較，通過行為學、形態(tài)學和分子水平實驗研究EDS的神經(jīng)保護作用及其作用機制。
　　通過神經(jīng)功能缺損評分，我們觀察到:短暫前腦缺血再灌注損傷后，溶劑對照組沙土鼠較假手術組動物表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)功能缺損，并具有統(tǒng)計學意義。而EDS治療后則可明顯緩解這種神經(jīng)功能缺損。進一步通過Morris水迷宮的定位巡航實驗和空間探索實驗，我們證實EDS對沙土鼠前腦缺血-再灌注損傷后學習記憶能力的下降具有明顯的治療作用。由于學習與

16、記憶的完成主要需要海馬區(qū)神經(jīng)元的支配作用，通過對海馬CA1區(qū)各組間Nissl染色和NeuN免疫組化染色觀察活性神經(jīng)元的數(shù)量、TUNEL染色觀察凋亡神經(jīng)元的情況，我們知道EDS的神經(jīng)保護作用可能是通過減少神經(jīng)元的凋亡、保留活性神經(jīng)元的數(shù)量而實現(xiàn)的。
　　由短暫前腦缺血再灌注損傷引起的TNF-α釋放增多，通過EDS(20mg/kg和50mg/kg)治療得到了明顯改善。由這些結果可推斷出EDS發(fā)揮神經(jīng)保護作用是通過其抗炎癥反應的特性而發(fā)

17、揮的。通過激光共聚焦免疫熒光實驗得出結論，在TNF-α和GFAP的組織化學免疫陽性細胞共定位。GFAP作為星形膠質細胞的特征性標志物與這TNF-α這種炎性因子共定位說明，前腦缺血引起星形膠質細胞活化，使其大量釋放TNF-α。我們的研究證實前腦缺血再灌注損傷后，沙土鼠海馬CA1區(qū)Iba-1陽性細胞數(shù)量和GFAP陽性細胞數(shù)量明顯增多，說明小膠質細胞和星形膠質細胞在缺血后活化。雖然星形膠質細胞和小膠質細胞在缺血后以相似的模式活化，它們不但發(fā)揮

18、不同的作用，而且在缺血后不同的時間階段和區(qū)域發(fā)揮作用。小膠質細胞較星形膠質細胞更早地釋放IL-1β和TNF-α，以至于我們還沒有通過實驗觀察到這個過程就結束了。而EDS可以減少前腦缺血-再灌注損傷后海馬CA1區(qū)星形膠質細胞和小膠質細胞的活化，而進一步減少TNF-α的表達，從而抑制炎癥反應。但是，我們還不清楚EDS發(fā)揮抗炎癥反應的作用，是單獨通過其抗氧化能力還是通過抑制膠質細胞活化而發(fā)揮的。
　　腦缺血損傷后，發(fā)生相應部位為主的氧化

19、應激反應和/或線粒體功能紊亂，最終導致凋亡級聯(lián)反應激活，引起神經(jīng)損傷。Caspase全稱為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，是一類蛋白酶家族，具有類似的結構并存在于細胞質中，在細胞凋亡的啟動和執(zhí)行中都發(fā)揮重要作用。Caspase有兩類，起始Caspase在凋亡刺激物的作用下被切割激活，其對執(zhí)行Caspase進行切割使其激活，然后通過對Caspase靶蛋白的水解最終導致程序性細胞死亡。在已被人們發(fā)現(xiàn)的10余種Caspase中，Caspase

20、-3在細胞凋亡中起著不可替代的作用。Pro-Caspase-3在活化過程中被剪切成兩種亞基后再組成具有活性形式的Caspase-3而進而引起凋亡。大量的實驗研究證實腦缺血后引起Caspase-3的上調。我們的實驗也得出結論，前腦缺血再灌注損傷后，通過EDS治療不但可以明顯降低沙土鼠海馬CA1區(qū)Caspase-3的表達，而且可以抑制它的活化，從而發(fā)揮神經(jīng)保護的作用。
　　結論
　　1、BCCAO方法造成沙土鼠短暫前腦缺血-再灌

21、注損傷模型未對血管造成副損傷。
　　2、EDS可明顯減少短暫前腦缺血-再灌注損傷沙土鼠的神經(jīng)功能缺損。
　　3、EDS可顯著改善短暫前腦缺血-再灌注損傷沙土鼠空間學習記憶能力的障礙。
　　4、EDS可以減少由短暫前腦缺血-再灌注損傷引起的沙土鼠海馬CA1區(qū)遲發(fā)性神經(jīng)元凋亡，從而增加存活正常功能神經(jīng)元的數(shù)量。
　　5、EDS可以抑制由短暫前腦缺血-再灌注損傷引起的星形膠質細胞和小膠質細胞的活化，從而抑制炎癥反應。<