胰高血糖素樣肽-1對正常人肝細胞作用機制的研究-PI3K通路.pdf

1、目的:
　　 1.體外培養(yǎng)正常人肝細胞L02系。
　　 2.研究胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)對正常人肝細胞的作用機制-P13K通路。
　　 3.為GLP-1有效的降糖、降低體重以及改善胰島素抵抗等臨床治療提供初步的理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.體外培養(yǎng)正常人肝細胞L02系,通過倒置顯微鏡形態(tài)學觀察。
　　 2.將培養(yǎng)的正常人肝細胞隨機分為7組:Ctrl組,GLP-1(10nmol

2、/l)組,GLP-1(1nmol/l)組,INS組(10nmol/l),INS組(1nmol/l),GLP-1(10nmol/l)+INS(10nmol/l)組,GLP-1(1nmol/l)+INS(1nmol/l)組,分別干預48小時。觀察各組細胞的形態(tài)學變化,并用MTT法檢測GLP-1、INS對正常人肝細胞存活數(shù)量和活力的影響,觀察兩種不同濃度的GLP-1與INS對人肝細胞的生長促進作用的差別。
　　 3.將培養(yǎng)的正常人肝細

3、胞隨機分為6組:Ctrl組,GLP-1(10nmol/l)組,INS組(10nmol/l),LY294002(15μmol/l)組,GLP-1(10nmol/l)+LY294002(15μmol/l)組,GLP-1(10nmol/l)+INS(10nmol/l)組,分別干預24小時后,用蛋白質(zhì)印跡(western blot)法測定各組總糖原合成酶(GS)、磷酸化糖原合成酶(P-GS)的表達,并計算糖原合成酶的活性。
　　 結(jié)果:

4、
　　 1.正常人肝細胞L02的傳代培養(yǎng)情況良好。
　　 2.GLP-1組、INS組、GLP-1+INS組肝細胞與Ctrl組相比細胞形態(tài)未有明顯改變,但可見GLP組、INS組、GLP-1+INS組肝細胞的生長速度較快。
　　 MTT結(jié)果表明:與Ctrl組相比,GLP-1組、INS組、GLP-1+INS組的OD值均明顯增高,表明GLP-1、INS單獨以及聯(lián)合應(yīng)用均使細胞存活數(shù)量及活力增加,促進人肝細胞的生長。與GL

5、P-1+INS相比,GLP-1組、INS組單獨應(yīng)用的OD值較低,表明GLP-1和INS聯(lián)合應(yīng)用對人肝細胞生長具有疊加作用。各干預組兩種濃度10nmol/l與1nmol/l對人肝細胞的生長促進作用沒有明顯差別,故以下的試驗步驟GLP-1和INS使用的終濃度均設(shè)為10nmol/l。
　　 3.western blot結(jié)果表明,GLP-1、INS均能增加人肝細胞總GS的表達量,降低失活狀態(tài)的P-GS的表達量,提高GS的活性,并且GLP

6、-1和INS聯(lián)合應(yīng)用對人肝細胞GS的影響有疊加作用。P13K阻斷劑LY294002在一定程度上阻斷了GLP-1促進人肝細胞總GS的表達、抑制P-GS的表達以及提高GS活性的作用。
　　 (1)與Ctrl組相比,GLP-1組、INS組、GLP-1+INS組的總GS的表達量均明顯增加,表明GLP-1、INS單獨及聯(lián)合應(yīng)用均促進人肝細胞總GS的表達；與GLP-1+INS組相比,GLP-1組、INS組單獨應(yīng)用時總GS的表達量較低,表明G

7、LP-1和INS聯(lián)合應(yīng)用對人肝細胞總GS的表達量的促進作用具有疊加效應(yīng)。與GLP-1組相比,GLP-1+LY294002組的總GS的表達量明顯減少,表明P13K的阻斷劑LY294002阻斷了GLP-1促進人肝細胞總GS的表達的作用。
　　 (2)與Ctrl組相比,GLP-1組、INS組、GLP-1+INS組的P-GS的表達量均明顯降低,表明GLP-1、INS單獨及聯(lián)合應(yīng)用均降低人肝細胞P-GS的表達；與GLP-1+INS組相比,

8、GLP-1組、INS組單獨應(yīng)用時P-GS的表達量較高,表明GLP-1和INS聯(lián)合應(yīng)用對人肝細胞P-GS的表達量的抑制作用具有疊加效應(yīng)。與GLP-1組相比,GLP-1+IX294002組人肝細胞的P-GS的表達量明顯增加,表明P13K阻斷劑LY294002在一定程度上阻斷了GLP-1抑制P-GS的表達的作用。
　　 (3)用P-GS/GS的比值來表示GS的活性,比值越大,GS的活性越低。結(jié)果顯示,與Ctrl組相比,GLP-1組、I

9、NS組、GLP-1+INS組GS的活性均明顯提高；與GLP-1+INS組相比,GLP-1組、INS組單獨應(yīng)用時GS的活性較低,表明GLP-1和INS聯(lián)合應(yīng)用對提高人肝細胞GS活性的作用具有疊加效應(yīng)。與GLP-1組相比,GLP-1+LY294002組的GS的活性明顯降低。
　　 結(jié)論:本研究通過體外試驗驗證了GLP-1可直接作用于人肝細胞,促進肝細胞的生長。試驗結(jié)果也證實了GLP-1通過增加人肝細胞總GS的表達量,降低失活狀態(tài)的P

10、-GS的表達量,從而使活性狀態(tài)的去磷酸化GS的表達量增加,來提高GS的活性,促進人肝細胞的糖原合成。在GLP-1干預的同時給予P13K阻斷劑LY294002后,人肝細胞總GS的表達量下降,而失活狀態(tài)的P-GS的表達量增加,活性狀態(tài)的去磷酸化GS的表達量減少,使得GS的活性降低,降低了GLP-1促進人肝細胞糖原合成的作用。由此可知,GLP-1誘導人肝細胞糖原合成增加的作用可能是通過激活P13K通路,使結(jié)合在細胞膜上的PKB/AKT脫落進入