胰高血糖素樣肽-1對(duì)高糖培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響.pdf

1、[研究背景] 隨著國(guó)家經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，國(guó)民生活方式的巨大改變，我國(guó)糖尿病患病率正呈快速上升趨勢(shì)。據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病分會(huì)2008年公布的調(diào)查結(jié)果，我國(guó)成人糖尿病的患病率已超過(guò)9％，糖調(diào)節(jié)受損的患病率已接近15％。糖尿病儼然已經(jīng)成為患者和社會(huì)的巨大負(fù)擔(dān)。
　　 隨著糖尿病病程的延長(zhǎng)，其慢性并發(fā)癥也日益增多，其中糖尿病腎病(DN)是糖尿病最主要的慢性并發(fā)癥之一，亦是1型糖尿病患者致死的主要原因。近些年來(lái)，隨著糖尿病發(fā)病率的逐年上升，D

2、N在世界范圍內(nèi)已成為引起終末期腎臟疾病(ESRD)的首要原因。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，在我國(guó)，DN也已成為繼慢性腎炎之后引起ESRD的第二大原因。
　　 DN的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，其基本病理改變是腎小球基底膜增厚，系膜細(xì)胞增生和細(xì)胞外基質(zhì)蓄積。高糖可通過(guò)多條途徑引起腎臟損害，眾多學(xué)者認(rèn)為多種因素共同作用導(dǎo)致了DN的發(fā)生。大量研究證實(shí)，糖尿病時(shí)，腎臟存在活性氧簇(ROS)堆積，如超氧陰離子、羥自由基、過(guò)氧化氫、一氧化氮等，腎臟組織內(nèi)原有

3、的氧化還原動(dòng)態(tài)平衡被破壞，因此，誘導(dǎo)了腎組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)，介導(dǎo)了DN的發(fā)生與發(fā)展。
　　 大量研究顯示，高糖狀態(tài)時(shí)，體內(nèi)發(fā)生著明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)，但高血糖狀態(tài)下引起ROS蓄積的確切原因目前尚不清楚，以往觀點(diǎn)認(rèn)為可能與糖的自身氧化，蛋白質(zhì)的非酶糖基化、多元醇通路被激活，蛋白激酶C(PKC)的活化，抗氧化系統(tǒng)清除能力下降等因素有關(guān)。最近有研究表明，高糖誘導(dǎo)的ROS主要產(chǎn)生于線粒體，高血糖首先引起細(xì)胞內(nèi)線粒體ROS生成增多，導(dǎo)致線粒

4、體功能紊亂，進(jìn)而激活氧化應(yīng)激相關(guān)的通路，再活化其下游途徑，導(dǎo)致組織受損。
　　 線粒體是細(xì)胞內(nèi)能量合成的重要場(chǎng)所，80％～90％的ATP在線粒體呼吸鏈氧化磷酸化過(guò)程中生成。線粒體作為細(xì)胞有氧呼吸的主要場(chǎng)所，通過(guò)和電子傳遞鏈相耦連的氧化磷酸化反應(yīng)將ADP和無(wú)機(jī)磷酸合成ATP，ROS產(chǎn)生于電子經(jīng)NADH或FADH2通過(guò)電子傳遞體傳遞給分子氧的呼吸作用的過(guò)程中。分子氧作為電子傳遞鏈過(guò)程中電子與質(zhì)子氫的末端受體，能促發(fā)化學(xué)氧化的過(guò)程，并

5、與一個(gè)電子相結(jié)合使其生成超氧陰離子，從而再形成羥自由基。由于線粒體DNA位于呼吸鏈周邊，無(wú)法避免遭受氧化損傷，因而形成惡性循環(huán)，氧化損傷被放大。氧化磷酸化過(guò)程中也可產(chǎn)生ROS，線粒體既是ROS產(chǎn)生的主要場(chǎng)所，也是ROS攻擊的主要部位，線粒體功能狀態(tài)的好壞對(duì)細(xì)胞功能有著直接的影響。線粒體ROS生成過(guò)多可能為糖尿病慢性并發(fā)癥的共同發(fā)生機(jī)制。因此，保護(hù)線粒體的結(jié)構(gòu)的完整性和一定的活力，避免線粒體氧化損傷，可成為防治糖尿病慢性并發(fā)癥的新方向和研

6、究藥物的重要突破點(diǎn)。由于ROS具有高度的反應(yīng)性，可以與周圍物質(zhì)迅速發(fā)生反應(yīng)，檢測(cè)較為困難，故體內(nèi)氧化應(yīng)激的定量描述主要根據(jù)于ROS與脂質(zhì)、DNA、蛋白質(zhì)反應(yīng)后的氧化代謝產(chǎn)物和體內(nèi)抗氧化酶的測(cè)定，可通過(guò)檢測(cè)MDA、GSH、SOD的含量來(lái)間接反應(yīng)氧化應(yīng)激損傷的程度。
　　 國(guó)內(nèi)外大量研究證明，眾多抗氧化劑能治療糖尿病患者體內(nèi)發(fā)生的氧化損傷反應(yīng)，如谷胱甘肽、Vit、α-硫辛酸、輔酶Q10、生物類黃酮等。另外近來(lái)發(fā)現(xiàn)臨床常用藥物，如噻唑

7、烷二酮類、瑞格列奈、他汀類藥物、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑、鈣離子通道阻滯劑兼有較強(qiáng)的抗氧化活性，為DN的治療開(kāi)拓了新的方向，并且上述藥物單用或聯(lián)用還具有降低血糖、降低血壓、調(diào)節(jié)血脂和抗炎等多種功效，在治療DN方面有十分廣闊的前景。胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）作為新近發(fā)現(xiàn)的降糖藥物，在糖尿病的治療中起著舉足輕重的作用，GLP-1是一種主要由位于回腸和結(jié)腸的Langerhans細(xì)胞分泌，十二指腸和空腸的L細(xì)胞也有少

8、量分泌的具有30個(gè)氨基酸的多肽，其是胰高血糖素原前體基因的產(chǎn)物，該基因編碼由160個(gè)氨基酸組成的肽類前體。是目前所知最強(qiáng)的葡萄糖依賴型的胰島素分泌促進(jìn)激素。GLP-1是第一個(gè)被描述的腸促胰島素(incretin)，是一種進(jìn)餐時(shí)由胃腸道系統(tǒng)生成的肽類物質(zhì)，具有促進(jìn)胰腺β細(xì)胞葡萄糖依賴性的釋放胰島素的功能。除此之外，GLP-1還具有降低血漿中的胰高血糖素水平，減低胃排空的速度，增強(qiáng)飽食感及刺激胰島B細(xì)胞的增殖與分化等多種生理活性，這些特性使

9、眾多學(xué)者認(rèn)為GLP-1可能成為未來(lái)2型糖尿病的最佳治療藥物，日益成為糖尿病治療新藥物研究的熱點(diǎn)。
　　 GLP-1通過(guò)與GLP-1受體(GLP-1R)結(jié)合并發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，它是一個(gè)與G蛋白偶聯(lián)的7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)通過(guò)cAMP傳遞信號(hào)，GLP-1在調(diào)節(jié)胰島素及胰升血糖素分泌、調(diào)節(jié)食欲、胃腸功能穩(wěn)態(tài)方面起到了重要的功能。GLP-1的分泌功能的異常就有可能導(dǎo)致代謝的紊亂，眾多研究已證實(shí)2型糖尿病的發(fā)生與GLP-1分泌減少相關(guān)。近來(lái)文

10、獻(xiàn)報(bào)道GLP-1在糖尿病腎病治療中起到一定的治療作用，GLP-1受體在體內(nèi)分布廣泛，除胰島細(xì)胞外還在心臟、肺組織中也發(fā)現(xiàn)有GLP-1受體的表達(dá)，具有舒張血管、降低血壓及保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能。部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示可刺激肝臟即骨骼肌細(xì)胞中糖原的合成，還發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的多個(gè)部位有GLP-1受體存在，但主要存在于丘腦，在腦室中注入GLP-1可抑制食物及水的攝入。同時(shí)GLP-1受體也廣泛分布于腎小球系膜細(xì)胞，GLP-1類似物艾塞那肽(Exendin-

11、4)與GLP-1氨基酸序列具有53％同源，是GLP-1受體的激動(dòng)劑，且不易被被體內(nèi)的二肽基肽酶Ⅳ(DPP-Ⅳ)降解，有文獻(xiàn)報(bào)道GLP-1類似物艾塞那肽能夠延緩糖尿病腎病的進(jìn)程，同時(shí)發(fā)現(xiàn)高糖狀態(tài)下經(jīng)艾塞那肽干預(yù)的人腎小球系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)化生子因子β1和結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的表達(dá)亦相應(yīng)減少，GLP-1類似物利拉魯肽能夠減少1型糖尿病大鼠尿蛋白的含量。
　　 目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)GLP-1減輕糖尿病腎病機(jī)制的研究報(bào)道極少，設(shè)想用GLP-1干預(yù)高糖培

12、養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞，觀察干預(yù)后氧化應(yīng)激指標(biāo)變化，探討GLP-1對(duì)高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制。
　　 [目的] 研究高糖對(duì)體外培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞(GMC)增殖和氧化應(yīng)激，并進(jìn)一步探討不同濃度GLP-1對(duì)腎臟的保護(hù)作用。
　　 [方法]
　　 1.將腎小球系膜細(xì)胞按如下分組培養(yǎng):正常糖組(5.5mmol/L)，高糖組25mmol/L)，高糖+GLP-1(3nmol/L)組，高糖+GLP-1(10nmo

13、l/L)組，高糖+GLP-1(30nmol/L)組，高糖+GLP-1(100nmol/L)組，分別培養(yǎng)24h。
　　 2.CCK8試劑盒法測(cè)細(xì)胞增殖率。
　　 3.流式細(xì)胞儀法測(cè)細(xì)胞活性氧(ROS)分別以二氯氫化熒光素(DFCH-DA)標(biāo)記細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)二氯熒光黃(DCF)的熒光強(qiáng)度而測(cè)得細(xì)胞內(nèi)ROS水平。
　　 4.酶標(biāo)儀法測(cè)細(xì)胞上清液中超氧化物歧化酶(SOD)活性和還原型谷胱甘肽(GSH)含量

14、，比色法測(cè)丙二醛(MDA)含量。
　　 [結(jié)果]
　　 1.與正常糖組對(duì)比，高糖組腎小球系膜細(xì)胞增殖率增高。
　　 2.與正常糖組對(duì)比，高糖組細(xì)胞內(nèi)DCF平均熒光強(qiáng)度升高。
　　 3.與正常糖組對(duì)比，高糖組SOD及GSH含量下降，MDA含量升高。
　　 4.干預(yù)組，給予GLP-1(3nmol/L)干預(yù)高糖組細(xì)胞內(nèi)DCF平均熒光強(qiáng)度無(wú)明顯影響，給予GLP-1(10-100nmol/L)可使高糖組細(xì)胞

15、內(nèi)DCF平均熒光強(qiáng)度下降，但給予GLP-1（10nmol/L與30nmol/L）組下降無(wú)明顯區(qū)別。
　　 5.干預(yù)組，給予GLP-1(3nmol/L)干預(yù)高糖組細(xì)胞上清液中SOD、GSH、MDA含量無(wú)明顯影響，給予GLP-1(10-100nmol/L)可使高糖組細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH含量升高，MDA含量下降，但給予GLP-1(10nmol/L與30nmol/L)組GSH、SOD、MDA含量無(wú)明顯區(qū)別。
　　 [結(jié)論]低濃度