尿酸調(diào)控脂肪組織RAS及其與肥胖性高血壓的相關(guān)性.pdf

1、背景:
　　高血壓病是最常見(jiàn)的肥胖相關(guān)性疾病。肥胖性高血壓病因十分復(fù)雜,迄今尚未完全闡明。高尿酸血癥(Hyperuricemia, HUA)是肥胖患者常見(jiàn)的代謝紊亂狀態(tài)。近年來(lái),有大量研究發(fā)現(xiàn),血尿酸與多種心血管疾病和代謝性疾病密切相關(guān),如高血壓病、肥胖、2型糖尿病、代謝綜合征等。這些疾病中,血尿酸與高血壓發(fā)病機(jī)制之間的聯(lián)系引起研究者極大的興趣。盡管具體的機(jī)制尚不清楚,但來(lái)自流行病學(xué)、臨床試驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)表明,高尿酸血癥參與了

2、肥胖性高血壓的發(fā)病。
　　文獻(xiàn)報(bào)道,脂肪組織幾乎表達(dá)腎素-血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin system, RAS)的全部組分[1]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究數(shù)據(jù)表明,白色脂肪組織所表達(dá)的血管緊張素原(Angiotensinogen, AGT)和血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)是循環(huán)池RAS的重要來(lái)源,在機(jī)體血壓調(diào)控中發(fā)揮重要作用[2]。脂肪組織AGT缺乏的小鼠血漿AGT水平更低,收縮壓隨之降低[3]。

3、研究發(fā)現(xiàn),原發(fā)性高血壓患者血漿腎素濃度與血尿酸水平明顯正相關(guān)[4]。然而,血漿AGT濃度與血尿酸之間在肥胖的原發(fā)性高血壓患者中是否存在關(guān)聯(lián),目前尚不清楚。
　　迄今為止,研究者發(fā)現(xiàn)有多種因素與脂肪組織RAS的調(diào)控相關(guān)[5],包括機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、胰島素、糖皮質(zhì)激素、游離脂肪酸、雄激素、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor alpha, TNFα)以及環(huán)磷腺苷(Cyclic adenosine monophosp

4、hate, cAMP)等。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),尿酸可以對(duì)幾種組織RAS發(fā)揮調(diào)控作用,包括永生化人系膜細(xì)胞(Immortalized human mesangial cells, ihMCs)組織RAS[6]、人血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human vascular endothelial cells, HVECS)組織RAS[7]、血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth cells, VSMCs)組織RAS[8]。肥胖患者脂肪組織RAS處于過(guò)度活

5、躍狀態(tài)[9]。針對(duì)這種有趣的現(xiàn)象,最常見(jiàn)的解釋是:與體型正常的個(gè)體比較,肥胖患者體內(nèi)脂肪含量明顯增多。研究發(fā)現(xiàn),尿酸與脂肪組織 RAS均在肥胖性高血壓發(fā)病中發(fā)揮重要作用,由此推斷,尿酸很可能對(duì)脂肪組織RAS表達(dá)也發(fā)揮調(diào)控作用。
　　眾所周知,肥胖性高血壓是一種氧化應(yīng)激相關(guān)性心血管疾病[10]。多個(gè)研究證實(shí),在一定條件下,尿酸可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激發(fā)生。據(jù)報(bào)道[11],高濃度尿酸作用于3T3-L1脂肪細(xì)胞,可以明顯增加細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(Re

6、active oxygen species, ROS)水平。雖然發(fā)現(xiàn)尿酸是通過(guò)上調(diào)NADPH氧化酶(NADPH oxidase, NOX)活性誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞氧化應(yīng)激的,然而,研究者并未闡明尿酸增加NOX活性具體的分子機(jī)制。
　　針對(duì)以上問(wèn)題,本課題嘗試通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)和臨床研究?jī)蓚€(gè)層面進(jìn)行深入探索。首先,利用3T3-L1脂肪細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?我們研究尿酸是否可以對(duì)脂肪組織RAS發(fā)揮調(diào)控作用。接下來(lái),我們探討脂肪組織RAS激活在尿酸誘導(dǎo)的

7、氧化應(yīng)激發(fā)病分子機(jī)制中的作用。最后,以324例未治療的原發(fā)性高血壓患者為研究對(duì)象,我們觀察血尿酸與血漿 AGT濃度是否存在關(guān)聯(lián),以及這種關(guān)聯(lián)是否因肥胖狀態(tài)而存在差異。以上研究將為闡明尿酸參與肥胖相關(guān)性心血管疾病(尤其是高血壓病)的發(fā)病機(jī)制提供新的視角。
　　方法:
　　1.以不同濃度的尿酸(0、1、5、15 mg/dl)作用未分化的前脂肪細(xì)胞48小時(shí),或以高濃度尿酸(5、15 mg/dl)作用于分化第4天的3T3-L1脂肪細(xì)

8、胞48小時(shí)。實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)AGT mRNA水平。
　　2.不同濃度尿酸(0、1、5、15 mg/dl)作用于分化成熟的3T3-L1脂肪細(xì)胞48小時(shí),或以15 mg/dl尿酸作用于成熟脂肪細(xì)胞不同時(shí)間(0、24、48、96小時(shí))。部分細(xì)胞在15 mg/dl尿酸聯(lián)合2mM probenecid條件下孵育48小時(shí)。實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)脂肪組織RAS基因表達(dá),酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme linked immunosorbent

9、assay, ELISA)檢測(cè)培養(yǎng)液AngⅡ的蛋白表達(dá)量。
　　3.成熟脂肪細(xì)胞在15 mg/dl尿酸聯(lián)合10-4 M氯沙坦或10-4 M卡托普利條件下孵育48小時(shí)。分別以實(shí)時(shí)RT-PCR和ELISA法檢測(cè)AGT mRNA水平和AngⅡ的蛋白分泌量。以比色法定量檢測(cè)NOX的酶活性。
　　4.成熟脂肪細(xì)胞以高濃度尿酸(5、15 mg/dl)干預(yù)48小時(shí)。另外,部分細(xì)胞在15 mg/dl尿酸聯(lián)合RAS抑制劑(10-4 M氯沙坦或

10、10-4 M卡托普利)條件下孵育,部分細(xì)胞在15 mg/dl尿酸聯(lián)合10mM N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, NAC)或200μM apocynin(一種NOX抑制劑)條件下孵育。熒光探針2',7'-二氯雙乙酸鹽(2′,7′- dichlorofluorescin diacetate, DCFH-DA)或二氫羅丹明(Dihydrogen rhodamine123, DHR)或NBT法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧含量。定性

11、檢測(cè)采用熒光顯微鏡,定量檢測(cè)采用熒光酶標(biāo)儀。
　　5.臨床研究共納入162例未經(jīng)治療的肥胖的男性高血壓患者,同期納入162例與之年齡相匹配的男性非肥胖高血壓患者。人體學(xué)指標(biāo)由專(zhuān)門(mén)護(hù)士測(cè)量,包括血壓、身高、體重、腰圍、臀圍等。全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)空腹血糖、血尿酸、血肌酐和血脂水平。空腹胰島素(Fasting insulin levels, FINS)水平以放射免疫法檢測(cè)。穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估的胰島素抵抗指數(shù)(Homeostasis mode

12、l assessment of insulin resistance, HOMA-IR)用于衡量機(jī)體胰島素抵抗程度。血漿AGT濃度以ELISA法檢測(cè)。
　　6.肥胖高血壓組與非肥胖高血壓組組間指標(biāo)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或卡方檢驗(yàn)。肥胖高血壓組與非肥胖高血壓組按尿酸三分位數(shù)分別再劃分為三個(gè)亞組,采用單因素ANOVA進(jìn)行組間比較,采用Bonferrroni’spost hoc檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。尿酸與其他參數(shù)的相關(guān)性采用偏相關(guān)分析(調(diào)整

13、年齡、吸煙史、飲酒史)。肥胖高血壓人群血尿酸對(duì)血漿 AGT水平的獨(dú)立影響以多元回歸模型進(jìn)行分析與評(píng)估。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS17.0軟件,作圖采用GraphPad prism5.0軟件。
　　結(jié)果:
　　1.不同濃度的尿酸對(duì)未分化的前脂肪細(xì)胞AGT mRNA表達(dá)無(wú)明顯作用(P>0.05)。然而,高濃度尿酸(5、15 mg/dl)可以使分化中的3T3-L1脂肪細(xì)胞AGT mRNA表達(dá)明顯增加(均P<0.05)。
　　2.分

14、化成熟的脂肪細(xì)胞在生理濃度尿酸(1 mg/dl)作用下,AGT mRNA變化不明顯(P>0.05),但高濃度尿酸(5、15 mg/dl)作用可以使脂肪組織RAS基因表達(dá)和AngⅡ蛋白分泌量明顯上調(diào)(均P<0.05)。15 mg/dl尿酸作用于脂肪細(xì)胞24小時(shí),AGT mRNA變化不明顯(P>0.05);作用48小時(shí)或96小時(shí),AGT mRNA表達(dá)和AngⅡ蛋白產(chǎn)量明顯增加(均P<0.05)。而且,尿酸對(duì)脂肪RAS的調(diào)控作用具有濃度依賴(lài)性

15、和時(shí)間依賴(lài)性特點(diǎn)。另外,陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)子(Organic anion transporter, OAT)抑制劑probenecid可以明顯減弱尿酸對(duì)脂肪組織RAS的活化作用。
　　3.與單純高尿酸組(15 mg/dl)比較,10-4 M氯沙坦或10-4 M卡托普利聯(lián)合高尿酸組AGT mRNA和AngⅡ蛋白水平均明顯減少(均P<0.05)。并且,氯沙坦和卡托普利可以使高濃度尿酸激活的NOX酶活性顯著下降(均P<0.05)。
　　4

16、.高濃度尿酸(5、15 mg/dl)使脂肪細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯增加(均P<0.05)。RAS抑制劑氯沙坦和卡托普利可以明顯減少高濃度尿酸作用下的脂肪細(xì)胞內(nèi) ROS水平(均P<0.05)。而且,抗氧化劑NAC或NOX抑制劑apocynin聯(lián)合高尿酸培養(yǎng)脂肪細(xì)胞,也能降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平(均P<0.05)。
　　5.肥胖高血壓患者腰圍、腰臀比和體重指數(shù)顯著升高。此外,與非肥胖高血壓患者比較,肥胖高血壓患者飲酒比例增高,甘油三酯、空腹血

17、糖、血尿酸、AGT、FINS、HOMA-IR及收縮壓升高(均P﹤0.05)。按尿酸三分位數(shù)將患者劃分為三個(gè)亞組,結(jié)果顯示,肥胖高血壓患者最高尿酸三分位數(shù)組(血尿酸435.9~642.2μmol/L)與最低尿酸三分位數(shù)組(血尿酸282.7~373.6μmol/L)比較,AGT(P﹤0.001)、FINS(P=0.002)、HOMA-IR(P=0.007)均明顯升高。然而,非肥胖高血壓患者組按尿酸三分位數(shù)劃分后,沒(méi)有發(fā)現(xiàn)類(lèi)似差異(P>0.0

18、5)。
　　6.調(diào)整年齡、吸煙史、飲酒史后,偏相關(guān)分析結(jié)果顯示,肥胖高血壓患者血尿酸與AGT(r=0.437, P﹤0.001)、FINS(r=0.245, P=0.002)、HOMA-IR(r=0.237, P=0.003)明顯相關(guān)。然而,非肥胖高血壓患者血尿酸與 AGT、FINS以及 HOMA-IR無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。多元逐步回歸分析結(jié)果顯示,交互變量“肥胖×尿酸”獨(dú)立影響高血壓患者血漿AGT水平(β=0.257,

19、P﹤0.001)。
　　結(jié)論:
　　1.尿酸可以上調(diào)分化中和分化成熟的脂肪組織RAS表達(dá),但對(duì)未分化的前脂肪細(xì)胞無(wú)此作用。尿酸必須通過(guò)尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子進(jìn)入脂肪細(xì)胞內(nèi),才能發(fā)揮對(duì)脂肪組織RAS的調(diào)控作用。
　　2.脂肪組織RAS過(guò)度激活參與了尿酸誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激發(fā)病的分子機(jī)制:尿酸上調(diào)脂肪組織RAS,增加AngⅡ產(chǎn)生,繼而激活NOX活性、增加脂肪細(xì)胞內(nèi)ROS水平,最終誘導(dǎo)氧化應(yīng)激發(fā)生。
　　3.高血壓患者血尿酸水平與血漿