鼠骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元定向誘導(dǎo)分化.pdf

1、一、概述。 帕金森病(ParkinsonDisease，PD)是一種中老年人常見的以黑質(zhì)紋狀體區(qū)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性缺失為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其特征是震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)減少。病理改變以黑質(zhì)致密層多巴胺神經(jīng)元部分缺失、神經(jīng)元中有路易小體(Lewybody,LB)形成等為特點(diǎn)。其發(fā)病率在整體人群為0.1％，在65歲以上人群高達(dá)1％。隨著社會(huì)老齡化，帕金森病的發(fā)病率和致殘率有增多趨勢(shì)。 骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BoneMarro

2、wStromalCells，BMSCs)已經(jīng)逐漸成為部份神經(jīng)系統(tǒng)疾病移植治療的理想的種子細(xì)胞來(lái)源，體外培養(yǎng)的BMSCs在一定的條件下可以跨系橫向分化為NSCs，學(xué)者稱之為骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞(BMSCs-D-NSCs)。同時(shí)，BMSCs作為誘導(dǎo)NSCs的細(xì)胞來(lái)源具有取材方便、來(lái)源充足和自體移植時(shí)不存在免疫排斥的危險(xiǎn)等優(yōu)點(diǎn)，又避開了倫理道德的爭(zhēng)論。另外，BMSCs也是很好的組織工程細(xì)胞，外源性基因轉(zhuǎn)入BMSCs后可得到有效和持久地表達(dá)并定向

3、分化，加速中樞神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)的進(jìn)程。目前國(guó)內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)了BMSCs-D-NSCs在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)和損傷的作用。 腺相關(guān)病毒(adeno-associatedvirus，AAV)常用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的轉(zhuǎn)基因載體。構(gòu)建攜帶目的基因的重組AAV載體轉(zhuǎn)染BMSCs-D-NSCs治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病是成熟的有效的途徑之一。 本實(shí)驗(yàn)的設(shè)想是構(gòu)建攜帶Nurrl基因的重組AAV載體轉(zhuǎn)染BMSCs-D-NSCs，促進(jìn)其發(fā)育

4、成為表達(dá)TH基因的DA能神經(jīng)元，再把表達(dá)TH基因的基因工程細(xì)胞(DA能神經(jīng)元)移植到MPTP制作的大鼠帕金森病模型中，研究經(jīng)過基因修飾的BMSCs-D-NSCs在體外和體內(nèi)表達(dá)Nurrl和TH基因的以及相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)分泌的情況，從而為轉(zhuǎn)基因治療PD建立一條新的途徑。 二、主要實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果。 1、BMSCs-D-NSCs的誘導(dǎo)分化。無(wú)菌條件下抽取成年SD四肢管狀骨骨髓，用密度梯度離心法取出BMSCs，在一定的條件下對(duì)其進(jìn)行

5、傳代培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化，成為BMSCs-D-NSCs。 結(jié)果：行免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞表達(dá)Nestin、NSE和NeuN抗原，BMSCs經(jīng)體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化出神經(jīng)元樣細(xì)胞。 2、重組AAV-pcDNA3.1-Nurrl真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定。采用分子克隆技術(shù)構(gòu)建重組AAV-pcDNA3.1-Nurrl真核表達(dá)載體，利用雙酶切和測(cè)序的方法對(duì)質(zhì)粒和插入的Nurrl的片段進(jìn)行鑒定。 結(jié)果：真核表達(dá)載體pcDNA3.

6、1-Nurrl的質(zhì)粒酶切鑒定。將連接產(chǎn)物pcDNA3.1-Nurrl用限制性內(nèi)切酶BamHI消化，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離得到了大小為1069bp和5510bp的條帶，用XhoI+XbaI消化后，得到1879bp和4700bp的條帶。將上述經(jīng)酶切鑒定的連接產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序，得到序列完全正確的pcDNA3.1-Nurrl連接產(chǎn)物。上述結(jié)果與預(yù)期相符。重組AAV-pcDNA3.1-Nurrl真核表達(dá)載體正確構(gòu)建。 3、pcDNA3.1

7、-Null在體外對(duì)BMSCs-D-NSCs的轉(zhuǎn)染。以脂質(zhì)體法在在體外對(duì)BMSCs-D-NSCs的轉(zhuǎn)染，檢測(cè)BMSCs-D-NSCs中Nurrl基因的表達(dá)，并且在一定的條件下(分別在培養(yǎng)液中加入DIP—潘生丁和GDNF)培養(yǎng)1周，檢測(cè)Nurrl-BMSCs-D-NSCsTH基因的表達(dá)，高效液相檢測(cè)培養(yǎng)液中DA濃度。分組如下：BMSCs-D-NSCs、BMSCs-D-NSCs+DIP、BMSCs-D-NSCs+GDNF、BMSCs-D-NS

8、Cs+Nurrl、BMSCs-D-NSCs+Nurrl+DIP、BMSCs-D-NSCs+Nurrl+GDNF、BMSCs-D-NSCs+Nurrl+DIP+GDNF和中腦黑質(zhì)DA神經(jīng)元共八組。 結(jié)果： (1)、Nurrl基因在BMSCs-D-NSCs中過表達(dá)，呈胞漿染色。 (2)、Nurrl-BMSCs-D-NSCs按在培養(yǎng)液中加入誘導(dǎo)因子分組培養(yǎng)1周后進(jìn)行檢測(cè)Nurrl基因和TH基因的表達(dá)。 ①免疫細(xì)

9、胞化學(xué)染色結(jié)果，Nurrl(+)的組別是BMSCs-D-NSCs+Nurrl、BMSCs-D-NSCs+Nurrl+DIP、BMSCs-D-NSCs+Nurrl+GDNF、BMSCs-D-NSCs+Nurrl+DIP+GDNF和中腦黑質(zhì)DA神經(jīng)元。 ②RT-PCR檢測(cè)Nurrl(+)細(xì)胞，上述組別均出現(xiàn)710bp的條帶，以BMSCs-D-NSCs+Nurrl+DIP、BMSCs-D-NSCs+Nurrl+GDNF、BMSCs-D

10、-NSCs+Nurrl+DIP+GDNF的條帶最明顯，表示這三組Nurrl(+)細(xì)胞數(shù)較其它三組多。 ③免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果，TH(+)的組別是BMSCs-D-NSCs+Nurrl、BMSCs-D-NSCs+Nurrl+DIP、BMSCs-D-NSCs+Nurrl+GDNF、BMSCs-D-NSCs+Nurrl+DIP+GDNF和中腦黑質(zhì)DA神經(jīng)元，尤其中腦黑質(zhì)DA神經(jīng)元TH(+)表達(dá)較多。BMSCs-D-NSCs+Nurrl+

11、GDNF和BMSCs-D-NSCs+Nurrrl+DIP+GDNF少許細(xì)胞呈陽(yáng)性。Nurrl-BMSCs-D-NSCs在GDNF的作用下部分成熟分化為DA能神經(jīng)元。 ④高效液相電化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中DA的濃度，在BMSCs-D-NSCs+Nurrl+DIP+GDNF培養(yǎng)液中含有DA，濃度是0.92ng/ml/107個(gè)細(xì)胞。 BMSCs-D-NSCs在轉(zhuǎn)染Nurrl基因和在一定的培養(yǎng)條件下(GDNF)在體外部分被誘導(dǎo)分化

12、為表達(dá)TH(+)、分泌DA遞質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元。 4、Nurrl-BMSCs-D-NSCs對(duì)帕金森病模型SD大鼠腦內(nèi)移植的實(shí)驗(yàn)研究。 (1)、MPTP制作SD大鼠中腦黑質(zhì)致密區(qū)毀損PD模型。毀損2周后每周1次、每次30分鐘記錄阿樸嗎啡誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)所致的旋轉(zhuǎn)次數(shù)，平均7次/分鐘為模型成功標(biāo)準(zhǔn)。 (2)、第6周進(jìn)行BMSCs-D-NSCs腦內(nèi)移植的實(shí)驗(yàn)研究。以微量注射器把5μl的細(xì)胞懸液在立體定向儀定位下移植到毀損側(cè)中腦

13、黑質(zhì)致密區(qū)。每周記錄1次阿樸嗎啡誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)所致的旋轉(zhuǎn)次數(shù)。按移植細(xì)胞分8組，每組10只。正常組(C組)：正常SD大鼠；單純毀損組(SNC組)：MPTP毀損左側(cè)SNC區(qū)；毀損+GDNF治療組(SNC+GDNF組)：MPTP毀損+GDNF腦內(nèi)注射；細(xì)胞移植1組：MPTP毀損+BMSCs組；細(xì)胞移植2組：MPTP毀損+Nurrl-BMSCs-D-NSCs組；細(xì)胞移植3組：MPTP毀損+Nurrl-BMSCs-D-NSCs+DIP移植組；細(xì)胞移植

14、4組：MPTP毀損+Nurrl-BMSCs-D-NSCs+GDNF移植組；細(xì)胞移植5組：MPTP毀損+Nurrl-BMSCs-D-NSCs+GDNF+DIP移植組。飼養(yǎng)2個(gè)月后4％多聚甲醛灌注固定取腦組織作免疫組織化學(xué)染色觀察Nurrl和TH在毀損側(cè)中腦黑質(zhì)致密區(qū)的表達(dá)。 結(jié)果： (1)SD大鼠中腦黑質(zhì)致密區(qū)在MPTP毀損后阿樸嗎啡誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)所致的旋轉(zhuǎn)次數(shù)達(dá)到平均7次/分鐘以上，建立模型成功。 (2)在移植術(shù)后第7

15、、15天以阿撲嗎啡誘發(fā)大鼠旋轉(zhuǎn)的實(shí)驗(yàn)中毀損+GDNF治療組、細(xì)胞移植2、3、4、5組的旋轉(zhuǎn)次數(shù)均出現(xiàn)下降，各組差異不顯著。第30和60天的誘發(fā)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞移植4、5組的旋轉(zhuǎn)次數(shù)繼續(xù)下降，上述三個(gè)組別的旋轉(zhuǎn)次數(shù)出現(xiàn)反彈。細(xì)胞移植4、5組的旋轉(zhuǎn)次數(shù)在第60天檢查時(shí)分別下降到4.42±0.27和4.48±0.23次/分鐘，統(tǒng)計(jì)學(xué)比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)。 (3)細(xì)胞移植4組和細(xì)胞移植5組Nurrl(+)細(xì)胞數(shù)較多，兩組間無(wú)顯著差異。

16、細(xì)胞移植3組和細(xì)胞移植2組也有Nurrl(+)細(xì)胞明顯少于細(xì)胞移植4組和細(xì)胞移植5組Nurrl(+)細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞移植3組Nurrl(+)細(xì)胞數(shù)又顯著多于細(xì)胞移植2組。正常組可見少量個(gè)別Nurrl(+)細(xì)胞。其余各組均未見Nurrl(+)細(xì)胞。 (4)TH表達(dá)的情況。 正常組可見多量TH(+)細(xì)胞.細(xì)胞移植4組和細(xì)胞移植5組TH(+)細(xì)胞數(shù)較多，兩組間無(wú)顯著差異，但明顯少于正常組。其余各組均未見TH(+)細(xì)胞。 三

17、、結(jié)論。 1、骨髓基質(zhì)細(xì)胞在一定的條件下可以誘導(dǎo)分化為神經(jīng)干細(xì)胞。 2、正確構(gòu)建重組AAV-pcDNA3.1-Nurrl真核表達(dá)載體，酶切、測(cè)序和RT-PCR檢測(cè)達(dá)到預(yù)期實(shí)驗(yàn)要求。 3、pcDNA3.1-Nurrl在體外成功轉(zhuǎn)染骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)Nurrl，并且在GDNF的共作用下誘導(dǎo)Nurrl-BMSCs-D-NSCs分化為表達(dá)TH基因和分泌DA的多巴胺能神經(jīng)元。 4、表達(dá)Nurrl和TH基因的Nu