不同飼養(yǎng)層對人胚胎干細(xì)胞分化為多巴胺能神經(jīng)元的影響.pdf

1、研究目的：
　　小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)和人包皮成纖維細(xì)胞(HFFs)是人類胚胎干細(xì)胞(hESCs)建系和維持最常用的飼養(yǎng)層。MEFs和HFFs在hESCs增殖和狀態(tài)維持方面均有差異，且對hESCs的心肌細(xì)胞分化潛能有影響。本研究目的是評價MEFs和HFFs對hESCs的多巴胺能神經(jīng)分化的影響。
　　研究方法：
　　為了使培養(yǎng)條件變異對神經(jīng)分化影響的最小化，本研究選用了自有的、在MEFs建系的HN4人胚胎干細(xì)胞系

2、和在混合飼養(yǎng)層(MFCs，MEFs∶HFFs=1∶1)建系的P96人胚胎干細(xì)胞系。分化實(shí)驗(yàn)在無飼養(yǎng)層培養(yǎng)系統(tǒng)中完成。采用SMAD通道雙抑制劑誘導(dǎo)啟動多巴胺能神經(jīng)分化，采用倒置相差顯微鏡、免疫細(xì)胞化學(xué)法、實(shí)時熒光定量PCR、掃描電鏡和透射電鏡、以及膜片鉗等檢測方法從形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)標(biāo)記物、轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)、三維超微結(jié)構(gòu)、電生理特性等方面分析人胚胎干細(xì)胞源多巴胺能神經(jīng)元的各種特征。通過SPSS19.0軟件進(jìn)行分析。P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)

3、差異。
　　研究結(jié)果：
　　HN4和P96細(xì)胞系在分化過程中均表現(xiàn)出從典型鋪路石樣、高核質(zhì)比的干細(xì)胞形態(tài)分化為典型神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)變化過程。HN4和P96源神經(jīng)元均表達(dá)多巴胺脫羧酶(TH)陽性，P96系分化細(xì)胞中TH陽性細(xì)胞比率更高(P＜0.05)。掃描電鏡和透射電鏡結(jié)果顯示HN4和P96源多巴胺能神經(jīng)元均顯示典型的神經(jīng)元形態(tài)及突觸結(jié)構(gòu)，并形成復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示，與HN4神經(jīng)元相比，P96神經(jīng)元FOXA

4、2、PITX3、NURR1、TH表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)。膜片鉗結(jié)果顯示:在電壓鉗模式下，HN4和P96源多巴胺能神經(jīng)元均記錄到了電壓門控性鈉、鉀離子電流，γ-氨基丁酸(GABA)和谷氨酸(Glu)等配體門控性電流及自發(fā)性突觸后電流。在電流鉗模式下，HN4和P96源多巴胺能神經(jīng)元均記錄到了動作電位序列發(fā)放。動作電位發(fā)放的個數(shù)與去極化電流的強(qiáng)度均呈線性關(guān)系。HN4和P96源多巴胺能神經(jīng)元動作電位時程均大于2mS。HN4和P96源多巴胺能神

5、經(jīng)元靜息電位分別為-63.38±0.01和-58.7±0.04mV，閾電位分別為-36.15±0.34和-39.58±0.17mV，兩者差異呈顯著性。HN4和P96源多巴胺能神經(jīng)元對去極化注射電流刺激均呈現(xiàn)出“爆發(fā)”性的放射模式，在連續(xù)發(fā)放的動作電位序列中，動作電位幅度遞減，而動作電位的時程逐漸延長。
　　研究結(jié)論：
　　1、在MEFs和HFFs上的建系的人胚胎干細(xì)胞系HN4及P96均可以分化為形態(tài)成熟的多巴胺能神經(jīng)元，并且