過(guò)表達(dá)野生型及帕金森病相關(guān)突變型α-synuclein對(duì)人胚胎干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的影響.pdf

1、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一種常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變,α-synuclein是最早發(fā)現(xiàn)的與帕金森病相關(guān)的基因,其正常的生理功能尚不是很清楚,已有研究表明它在突觸可塑性的調(diào)節(jié)、突觸囊泡的循環(huán)、神經(jīng)遞質(zhì)的儲(chǔ)存和分布、神經(jīng)元的分化等過(guò)程中發(fā)揮作用,迄今對(duì)α-synuclein的研究主要集中在野生型與PD相關(guān)突變(A30P、E46K、A53T)與氧化應(yīng)激、線粒體功能異常、泛素-蛋白酶體蛋白降解系統(tǒng)的障礙和細(xì)

2、胞自噬功能異常之間的關(guān)系,而對(duì)α-synuclein及其PD相關(guān)突變(A30P、E46K、A53T)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育,尤其是多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育影響的研究不是很多。人類胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells,hESCs)具有自我更新和分化發(fā)育的潛能,目前利用人胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞,尤其是多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞分化的技術(shù)已比較成熟,該分化體系則能部分模擬人體正常的多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育分化,從而為我們研究α-synuclei

3、n及其PD相關(guān)突變(A30P、E46K、A53T)對(duì)多巴胺能神經(jīng)元分化影響的研究提供了一個(gè)工具。
　　 第一章:慢病毒轉(zhuǎn)染野生型及帕金森病相關(guān)突變型α-synuclein(A30P、A53T)到人胚胎干細(xì)胞。
　　 目的:獲得穩(wěn)定表達(dá)野生型及PD相關(guān)突變型α-synuclein(A30P、A53T)的人胚胎干細(xì)胞系
　　 方法:用293FT細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建好的野生型和突變型(A30P、A53T)α-synucl

4、ein-FUIGW-GFP慢病毒載體進(jìn)行包裝,收獲48h和72h的病毒上清并超速離心濃縮后,轉(zhuǎn)染人胚胎干細(xì)胞(H9),然后用機(jī)械法將表達(dá)熒光的細(xì)胞團(tuán)挑下來(lái)并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),鑒于每個(gè)胚胎干細(xì)胞團(tuán)塊的差異,將來(lái)自于同一個(gè)細(xì)胞團(tuán)塊的后代劃為一個(gè)細(xì)胞系,在以后的傳代中均根據(jù)GFP熒光對(duì)人胚胎干細(xì)胞進(jìn)行篩選,并對(duì)獲得的穩(wěn)定表達(dá)野生型及PD相關(guān)突變型α-synuclein(A30P、A53T)的人胚胎干細(xì)胞系進(jìn)行表面標(biāo)記檢測(cè)、體外擬胚體(embryo

5、id body,EB)、體內(nèi)畸胎瘤分化能力檢測(cè)。
　　 結(jié)果:將收獲的病毒上清超速離心濃縮后,轉(zhuǎn)染人胚胎干細(xì)胞(H9),大約7天左右有GFP熒光出現(xiàn),然后用機(jī)械法將表達(dá)熒光的細(xì)胞團(tuán)挑下來(lái)并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),在以后的傳代中均根據(jù)GFP熒光對(duì)人胚胎干細(xì)胞進(jìn)行篩選,對(duì)獲得的穩(wěn)定表達(dá)野生型及PD相關(guān)突變型α-synuclein(A30P、A53T)的人胚胎干細(xì)胞系進(jìn)行干細(xì)胞表面標(biāo)記檢測(cè)均為陽(yáng)性,并且在體外均能形成擬胚體(embryoid b

6、ody,EB),體內(nèi)能形成畸胎瘤。
　　 結(jié)論:①穩(wěn)定表達(dá)野生型α-synuclein和A30P、A53T突變的H9細(xì)胞保留了人胚胎干細(xì)胞的特性,具備體外體內(nèi)分化的能力。②在H9細(xì)胞中野生型和突變型(A30P,A53T)α-synuclein在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈彌散樣和一些顆粒樣的分布,隨著體外的繼續(xù)培養(yǎng),WT和A53T-α-synuclein蛋白表現(xiàn)為大的顆粒和囊泡樣的結(jié)構(gòu)。
　　 第二章:對(duì)穩(wěn)定表達(dá)野生型及PD相關(guān)突

7、變型α-synuclein(A30P、A53T)的H9細(xì)胞系向多巴胺能神經(jīng)元分化。
　　 目的:比較野生型及PD相關(guān)突變型α-synuclein(A30P、A53T)對(duì)人胚胎干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化的影響。
　　 方法:首先擴(kuò)大培養(yǎng)穩(wěn)定表達(dá)α-synuclein及其PD相關(guān)突(A30P、A53T)的H9細(xì)胞系,用Dispase消化并用ES培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)3天后,再用NPC培養(yǎng)基加bFGF培養(yǎng)3天,然后貼壁培養(yǎng)在包被有多聚

8、鳥(niǎo)苷酸和層粘連蛋白的培養(yǎng)皿內(nèi),用NPC培養(yǎng)基加FGF8和Shh培養(yǎng)6天后,挑取出現(xiàn)的“玫瑰花樣”團(tuán)塊,在NPC培養(yǎng)基加FGF8、SHH、B27、AA懸浮培養(yǎng)一周后,用accutase/trypsin(1:1)消化神經(jīng)球后,種在包被有l(wèi)aminin的爬片上,用NPC培養(yǎng)基加神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF、GDNF、FGF8、SHH、B27、AA、cAMP、laminin培養(yǎng),隔天換液。數(shù)天后檢測(cè)TH及α-synuclein的表達(dá)。
　　 結(jié)

9、果:在整個(gè)分化過(guò)程中,穩(wěn)定表達(dá)野生型和突變?chǔ)?synuclein人胚胎干細(xì)胞系均能形成神經(jīng)前體細(xì)胞及多巴胺能神經(jīng)元。在分化而來(lái)的神經(jīng)前體細(xì)胞,多巴胺能神經(jīng)元和非多巴胺神經(jīng)元中,WT和A53T-α-synuclein在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈大的顆粒樣的分布,沒(méi)有了在胚胎干細(xì)胞中的大的囊泡樣的結(jié)構(gòu),而A30P-α-synuclein主要為彌散樣的小顆粒分布。
　　 結(jié)論:①穩(wěn)定表達(dá)野生型和突變?chǔ)?synuclein人胚胎干細(xì)胞系均能形成神經(jīng)前體