LRIG3在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)及體內(nèi)外干擾LRIG3表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:
　　宮頸癌是全世界范圍內(nèi)同時(shí)也是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)生率位居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤第一位，且有逐年年輕化的趨向。近年來(lái)，隨著手術(shù)切除、化學(xué)治療、放射治療、及其它綜合性治療措施的應(yīng)用，對(duì)宮頸癌的治療有了一定程度的進(jìn)展，但療效并不十分理想。宮頸癌的病因及發(fā)生機(jī)制目前尚不十分明了，許多研究證明其發(fā)生、發(fā)展和浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移是多因素、多階段、多基因共同參與的非常復(fù)雜的過(guò)程，因此，探討宮頸癌的發(fā)病機(jī)制，尋找更有效的治療措施是當(dāng)前研

2、究的熱點(diǎn)課題之一。
　　LRIGs是最近發(fā)現(xiàn)的一組腫瘤相關(guān)基因，該家族共有三個(gè)成員:LRIG1、LRIG2、LRIG3。LRIGs編碼一組結(jié)構(gòu)上較為相似的膜整合蛋白，蛋白分為胞外段、跨膜區(qū)和一個(gè)胞漿內(nèi)尾巴，胞外段蛋白含有富含亮氨酸重復(fù)序列（LRRs）和3個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域。研究表明LRIG的表達(dá)能夠?qū)GFR信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控，從而起到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，但是我們對(duì)其分子和信號(hào)機(jī)制尚不清楚。近年來(lái)許多研究表明，LRIGs基因家族在

3、垂體瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和皮膚鱗狀細(xì)胞癌等多種腫瘤中具有抑癌作用。
　　LRIG3定位于人類(lèi)基因組12q13，在人類(lèi)腫瘤中LRIG3是高表達(dá)還是低表達(dá)尚不十分清楚，對(duì)于其在宮頸癌中表達(dá)的相關(guān)研究較少，對(duì)于其在宮頸癌細(xì)胞株中發(fā)揮的生物學(xué)作用尚未見(jiàn)報(bào)道。LRIG3和宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是否有相關(guān)性，抑制LRIG3表達(dá)對(duì)宮頸鱗癌的影響是本研究需要探討的核心。
　　目的:
　　檢測(cè)宮頸鱗癌組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變組織和正常宮頸粘膜組織中LR

4、IG3、EGFR和Ki67的表達(dá)，并分析其與宮頸鱗癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。觀察LRIG3反義核苷酸轉(zhuǎn)染到宮頸癌Hela229細(xì)胞中后對(duì)LRIG3和EGFR的表達(dá)以及對(duì)細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移以及細(xì)胞周期的影響。觀察LRIG3反義核苷酸對(duì)宮頸癌裸鼠移植瘤的影響。
　　第一部分LRIG3在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)及意義
　　方法:
　　應(yīng)用免疫組織化學(xué)和原位雜交檢測(cè)45例宮頸鱗癌組織、20例CIN組織和30例正常宮頸黏膜組織中LRIG3、EG

5、FR和Ki67表達(dá)，并結(jié)合臨床病理資料對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:
　　1.LRIG3蛋白和mRNA在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為35.56％和48.89％，顯著低于CIN組織（分別為70％、80％）和正常宮頸粘膜組織（皆為100％），兩兩間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。其蛋白和mRNA的表達(dá)強(qiáng)度與/和患者的年齡以及腫瘤大小無(wú)關(guān)（P均＞0.05），而與腫瘤的浸潤(rùn)程度、臨床分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成負(fù)相關(guān)（P均＜

6、0.05）。
　　2.EGFR蛋白和mRNA在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為80％和84.44％，顯著高于CIN組織（分別為35％、45％）和正常宮頸粘膜組織（分別為6.67％、16.67％），兩兩間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中EGFR蛋白和mRNA的表達(dá)強(qiáng)度與患者的年齡、腫瘤大小、臨床分期無(wú)關(guān)（P均＞0.05），而與腫瘤的浸潤(rùn)程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成正相關(guān)(P均＜0.05)。
　　3.

7、Ki67蛋白和mRNA在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為86.67％和91.11％，顯著高于CIN組織（分別為30％和50％）和正常宮頸粘膜組織（分別為3.33％、23.33％），兩兩間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Ki-67的表達(dá)與宮頸鱗癌各臨床病理因素均無(wú)相關(guān)性((P＞0.05)。
　　4.LRIG3和EGFR在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)呈負(fù)向相關(guān)，LRIG3和Ki67在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)亦呈負(fù)向相關(guān)。

8、
　　第二部分LRIG3的表達(dá)調(diào)控對(duì)宮頸鱗癌Hela229細(xì)胞周期、凋亡、侵襲力的影響
　　方法:
　　1.設(shè)計(jì)合成LRIG3反義寡核苷酸(LRIG3ASODN)、正義寡核苷酸序列(LRIG3SODN)以及錯(cuò)義寡核苷酸序列(LRIG3MSODN)，用脂質(zhì)體Lipofectamine2000包裹轉(zhuǎn)染Hela229細(xì)胞，作為轉(zhuǎn)染組細(xì)胞。將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為空白對(duì)照組細(xì)胞。
　　2.Westernblot檢測(cè)不同濃度

9、(150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml)LRIG3ASODN、LRIG3MSODN和LRIG3SODN轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h、48h及72h后LRIG3和EGFR蛋白表達(dá)情況。
　　3.RT-PCR檢測(cè)不同濃度(150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml)LRIG3ASODN、LRIG3MSODN和LRIG3SODN轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h、48h及72h后LRIG3和EGFRmRNA表達(dá)情況。
　　4.應(yīng)用MTT檢

10、測(cè)細(xì)胞增殖情況，細(xì)胞流式法測(cè)定細(xì)胞凋亡，細(xì)胞基質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞粘附能力，Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力。
　　結(jié)果:
　　1.ASODN組中LRIG3蛋白和mRNA表達(dá)較SODN組、MSODN組、空白對(duì)照組明顯降低(P＜0.05)，且有濃度依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性，LRIG3的表達(dá)隨轉(zhuǎn)染濃度的增加以及時(shí)間的延長(zhǎng)而減少。
　　2.ASODN組中EGFR蛋白和mRNA表達(dá)較SODN組、MSODN組、空白對(duì)照組明顯增

11、加(P＜0.05)，隨轉(zhuǎn)染濃度的增加及時(shí)間的延長(zhǎng)EGFR的表達(dá)隨之升高。EGFR表達(dá)和LRIG3表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
　　3.MTT實(shí)驗(yàn)表明LRIG3ASODN組Hela229細(xì)胞增殖率較其它組別明顯升高(P＜0.05)，隨著LRIG3ASODN轉(zhuǎn)染濃度增加，表達(dá)抑制時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.轉(zhuǎn)染LRIG3ASODN后Hela229細(xì)胞凋亡率明顯降低，隨著轉(zhuǎn)染濃度的增加，時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)

12、胞的凋亡率隨之降低。
　　5.細(xì)胞基質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)染LRIG3ASODN后使Hela229細(xì)胞粘附率明顯增高，隨著轉(zhuǎn)染濃度的增加，時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞的粘附率隨之升高。
　　6.Transwell實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)染LRIG3ASODN后使得Hela229細(xì)胞的遷徙能力明顯增高，ASODN組穿膜細(xì)胞數(shù)(246±10)明顯高于SODN組(168±10)、MSODN組（177±8）和空白對(duì)照組(176±6)。
　　第三部分LRIG3表

13、達(dá)調(diào)控對(duì)人宮頸鱗癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響
　　方法:
　　將1×107個(gè)Hela229細(xì)胞注射到裸鼠皮下構(gòu)建宮頸鱗癌裸鼠移植瘤模型，將LRIG3ASODN皮下注射到瘤體內(nèi)后觀察裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)狀態(tài)。測(cè)量各組種植瘤瘤體體積。Westemblot和RT-PCR檢測(cè)裸鼠移植瘤中LRIG3和EGFR蛋白和mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.ASODNLRIG3組注射后18-30天裸鼠細(xì)胞瘤體積較其它兩組明顯增高(P＜0.0

14、5)。
　　2.Westemblot和PT-PCR檢測(cè)裸鼠移植瘤中LRIG3蛋白和mRNA表達(dá)，顯示ASODN組LRIG3表達(dá)較MSODN和空白對(duì)照組明顯降低(P＜0.05)。
　　3.Westernblot和PT-PCR檢測(cè)裸鼠移植瘤中EGFR蛋白和mRNA表達(dá)，顯示ASODN組EGFR表達(dá)較MSODN和空白對(duì)照組明顯升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.宮頸鱗癌組織和CIN組織中LRIG3呈低表達(dá)，EG

15、FR高表達(dá)，其表達(dá)量與宮頸鱗癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。提示LRIG3通過(guò)對(duì)EGFR的負(fù)反饋調(diào)節(jié)起到抑制宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展的作用。
　　2.LRIG3ASODN能顯著下調(diào)宮頸鱗癌Hela229細(xì)胞中LRIG3蛋白和mRNA的表達(dá)，同時(shí)EGFR蛋白和mRNA表達(dá)上升，能抑制宮頸鱗癌細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞侵襲能力。提示LRIG3在宮頸鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲力中起著重要作用。
　　3.LRIG3ASODN可導(dǎo)致宮頸鱗癌裸鼠成瘤速度加快，體