P53調(diào)控的細(xì)胞自吞噬在DNA放射損傷反應(yīng)中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　p53基因是目前研究最廣泛的抑癌基因之一,也是細(xì)胞內(nèi)一個(gè)強(qiáng)大的轉(zhuǎn)錄因子,在各種應(yīng)激包括DNA輻射損傷時(shí),p53可被不同的信號(hào)通路激活,并通過(guò)增強(qiáng)其下游多種基因的轉(zhuǎn)錄而引起細(xì)胞周期阻滯、凋亡或衰老,保持細(xì)胞基因組的完整性并清除損傷細(xì)胞,對(duì)p53通路的深入研究可為腫瘤的發(fā)生發(fā)展及抗腫瘤藥物的研發(fā)提供重要信息,本課題圍繞p53在DNA放射損傷反應(yīng)中的作用及作用機(jī)制展開(kāi)了深入研究。
　　方法：
　　本實(shí)驗(yàn)主要采用細(xì)

2、胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn),計(jì)算輻射后細(xì)胞的存活率;采用胸腺嘧啶雙阻滯法同步化細(xì)胞周期于G1/S邊界,再通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期,分析p53野生型和缺失型細(xì)胞的各周期時(shí)相;采用western blotting檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白等的表達(dá);用鹽酸多柔比星處理細(xì)胞,再流式分析細(xì)胞的各個(gè)周期時(shí)相。利用慢病毒法構(gòu)建p53穩(wěn)定敲低及對(duì)照細(xì)胞系,并經(jīng)western blotting鑒定;利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)p53對(duì)p62/SQSTM1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用;

3、利用Annexin V-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞儀分析電離輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡情況;通過(guò)激光共聚焦免疫熒光實(shí)驗(yàn)和western blotting檢測(cè)自噬蛋白p62/SQSTM1的表達(dá);利用透射電鏡觀察細(xì)胞的自噬泡等方法。
　　結(jié)果：
　　本實(shí)驗(yàn)主要獲得如下結(jié)果:
　　1.p53增強(qiáng)電離輻射后細(xì)胞的存活,通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)電離輻射后,HCT116 p53+/+細(xì)胞的存活率明顯高于HCT116 p53-/-細(xì)胞。<

4、br>　　2.細(xì)胞受電離輻射損傷后,經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),HCT116 p53-/-細(xì)胞G2/M期阻滯的發(fā)生時(shí)間早于HCT116 p53+/+細(xì)胞,且G2/M期阻滯的時(shí)間明顯長(zhǎng)于HCT116 p53+/+細(xì)胞。
　　3.TdR雙阻滯法將細(xì)胞周期同步化于G1/S期邊界后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HCT116 p53-/-細(xì)胞的G2/M期明顯比HCT116 p53+/+細(xì)胞時(shí)間長(zhǎng)。
　　4.1μM Doxorubicin處理細(xì)胞后,流

5、式結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCT116 p53-/-細(xì)胞的S期蓄積明顯比HCT116 p53+/+細(xì)胞時(shí)間長(zhǎng)。
　　5.Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示p53穩(wěn)定敲低的A549細(xì)胞系構(gòu)建成功;經(jīng)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示,4Gy照射可以強(qiáng)烈激活p62基因啟動(dòng)的轉(zhuǎn)錄活性,在照射后2h時(shí),其轉(zhuǎn)錄增加了一倍。此外,在p53+/+細(xì)胞中,4h之后p62的轉(zhuǎn)錄會(huì)緩慢升高,在24h時(shí)下降,而在p53-/-細(xì)胞中,在4h經(jīng)歷短暫的下降之后,隨后迅速升

6、高,直到24h還沒(méi)有下降的趨勢(shì)。
　　6.對(duì)各種處理組合之后的不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞進(jìn)行流式分析,發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照細(xì)胞在照射8h左右發(fā)生G2/M阻滯,而p53敲低細(xì)胞則在4h左右發(fā)生G2/M阻滯,當(dāng)這兩種細(xì)胞在血清饑餓之后再進(jìn)行照射時(shí),G2/M期的阻滯明顯向后推遲,并且兩種細(xì)胞阻滯發(fā)生時(shí)間的差異也在縮小。
　　7.流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示,敲低p53的細(xì)胞凋亡率明顯低于p53正常細(xì)胞,血清饑餓組的細(xì)胞凋亡率明顯低于對(duì)照細(xì)胞,而3-MA

7、處理組的細(xì)胞凋亡率最高。
　　結(jié)論：
　　1,p53增強(qiáng)電離輻射后細(xì)胞的存活。
　　2,細(xì)胞受電離輻射損傷后,p53可能對(duì)G2/M期細(xì)胞檢查點(diǎn)的激活有抑制作用,且p53可能在G2/M期細(xì)胞轉(zhuǎn)換或M期細(xì)胞的退出中發(fā)揮重要調(diào)控作用。
　　3,p53在γ射線引起的DNA損傷反應(yīng)中,主要起到抑制自吞噬的作用,并且這種抑制作用很可能是通過(guò)抑制p62蛋白的轉(zhuǎn)錄激活實(shí)現(xiàn)的。
　　4,促進(jìn)自吞噬可以促進(jìn)電離輻射之后細(xì)胞的存