LyGDI在腫瘤細(xì)胞輻射凋亡敏感性中的作用與P53調(diào)控研究.pdf

1、目的：構(gòu)建1yGDI及AN191yGDI的帶有熒光標(biāo)記的真核表達(dá)載體并分析外源性表達(dá)1yGDI及AN191yGDI對輻射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞放射敏感性的影響并分析其機(jī)制；研究恢復(fù)細(xì)胞P53蛋白表達(dá)對細(xì)胞輻射誘導(dǎo)凋亡及LyGDI的影響。 方法： 1.設(shè)計1yGDI及AN191yGDI基因上下游引物，PCR擴(kuò)增基因片段，分別構(gòu)建pEGFP-DF-1yGDI及pEGFP-DF-AN191yGDI真核表達(dá)載體。經(jīng)酶切、PCR、測序

2、驗證其正確性；脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞MCF-7后免疫印跡檢測融合蛋白的表達(dá)，免疫組化觀察融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)定位； 2.脂質(zhì)體法以pcDNA3.1-wt p53轉(zhuǎn)染L929細(xì)胞，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，RT-PCR、免疫印跡法驗證；生長曲線法檢測細(xì)胞增殖能力的的變化；X射線照射后，克隆法檢測放射敏感性的變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率的改變，免疫印跡法檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)； 3.利用構(gòu)建成功的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染1yGDI及AN191yGDI基因

3、的L929、A549細(xì)胞。檢測轉(zhuǎn)染lyGDI對輻射誘導(dǎo)兩種細(xì)胞凋亡率的影響，探究其對細(xì)胞放射敏感性的影響，免疫印跡法檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：測序證明基因序列完全正確，免疫印跡和免疫熒光染色檢測到目的蛋白表達(dá)；恢復(fù)細(xì)胞P53蛋白的表達(dá)抑制了L929細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡并誘導(dǎo)LyGDI斷裂；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染1yGDI及AN191yGDI的L929細(xì)胞輻射誘導(dǎo)的凋亡率上升，輻射處理后觀察到融合蛋白斷裂成相對應(yīng)的LyGDI

4、及AN19LyGDI蛋白；穩(wěn)定轉(zhuǎn)染1yGDI的A549細(xì)胞輻射誘導(dǎo)的凋亡率上升，增加細(xì)胞放射敏感性，在該細(xì)胞受到8 Gy60Coγ射線照射后4到24小時可以觀察到LyGDI蛋白斷裂成AN19LyGDI蛋白。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建帶有GFP綠色熒光標(biāo)記的pEGFP-DF-1yGDI及pEGFP-DF-AN191yGDI真核表達(dá)載體； 2.恢復(fù)L929細(xì)胞的P53表達(dá)抑制細(xì)胞增殖能力，增加細(xì)胞放射敏感性并發(fā)現(xiàn)P53外