JNK信號(hào)通路及p53基因調(diào)控黏菌素誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞自噬作用研究.pdf

1、黏菌素(colistin)又稱(chēng)多黏菌素E，是堿性環(huán)狀的多肽類(lèi)抗生素，臨床常用其硫酸鹽，被認(rèn)為是治療多重耐藥革蘭氏陰性菌感染的有效藥物，但是由于黏菌素潛在的神經(jīng)毒性和腎毒性，限制了它在臨床的廣泛應(yīng)用。本課題組前期已經(jīng)證實(shí)黏菌素的神經(jīng)毒性，并發(fā)現(xiàn)其i可引起大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系（PC12細(xì)胞）凋亡和自噬，并在近期實(shí)驗(yàn)中得知黏菌素誘導(dǎo)的自噬發(fā)生于凋亡之前，并且該自噬具備凋亡的負(fù)調(diào)控能力;同時(shí)發(fā)現(xiàn)p53基因可參與黏菌素誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞自噬和凋

2、亡。由于凋亡和自噬的相互作用關(guān)系一直是該研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題，明確兩者之間的基因(p53)及信號(hào)通路（JNK）的作用及相關(guān)機(jī)制，將從分子水平上豐富該藥的毒理學(xué)資料，并可為尋找和開(kāi)發(fā)對(duì)抗黏菌素致神經(jīng)毒性的藥物或預(yù)防措施提供新路徑。
　　本次試驗(yàn)仍以PC12細(xì)胞為研究對(duì)象，分別運(yùn)用JNK信號(hào)通路抑制劑(SP600125)及活化劑(anisomycin)調(diào)節(jié)JNK在黏菌素誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中的活性。通過(guò)MTT法確定SP600125和ani

3、somycin在本試驗(yàn)中的最適濃度分別為20μM和4μM，PC12細(xì)胞經(jīng)20μMSP600125和4μM anisomycin預(yù)處理1h后，給予125μg·mL-1黏菌素作用12h，運(yùn)用 real-time PCR、Western blot、透射電鏡、免疫熒光和Hoechst33258染色等方法檢測(cè)細(xì)胞自噬和凋亡相關(guān)指標(biāo)及形態(tài)學(xué)變化，以探討JNK信號(hào)通路與黏菌素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬的關(guān)系;通過(guò)siRNA干擾技術(shù)使p53蛋白達(dá)有效沉默的目的，運(yùn)

4、用Western blot法鑒定p53沉默效率，然后采用4μManisomycin預(yù)處理沉默p53基因的PC12細(xì)胞，通過(guò)測(cè)定p53、p-JNK表達(dá)量及ROS含量，探討p53、JNK及ROS三者之間關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)果表明:
　　(1)與空白對(duì)照組相比，黏菌素可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞中JNK的活化，同時(shí)伴有Bcl2的活化，并且12h時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量最高，Bax表達(dá)量增加開(kāi)始于12h，并且呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。
　　(2)與陰性對(duì)照組相比（coli

5、stin組），SP600125預(yù)處理可使自噬相關(guān)基因和蛋白(Beclin1、和LC3)表達(dá)量顯著降低(p＜0.01)，p62表達(dá)量增加(p＜0.01)，電鏡觀察到自噬小體明顯減少;anisomycin預(yù)處理可致自噬相關(guān)基因和蛋白表達(dá)量增加(p＜0.01)，電鏡下可見(jiàn)自噬小體明顯增多，LC3免疫熒光點(diǎn)增加;并且伴隨凋亡基因及活化蛋白的表達(dá)量增加(p＜0.01)，細(xì)胞核固縮、偏移現(xiàn)象更加顯著。
　　(3)與陰性對(duì)照組相比，黏菌素誘導(dǎo)的

6、PC12細(xì)胞通過(guò)anisomycin活化JNK，自噬相關(guān)蛋白表達(dá)量增加，同時(shí)伴有Bcl2的活化，并且在6h時(shí)間點(diǎn)時(shí)表達(dá)量最高;同時(shí)伴有Bax表達(dá)量的增加，凋亡相關(guān)蛋白(caspase3、PARP)活化開(kāi)始于6h，并且呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。
　　(4)與陰性對(duì)照組相比(colistin+sip53)，anisomycin預(yù)處理導(dǎo)致ROS含量顯著增加，同時(shí)p-JNK蛋白表達(dá)量顯著增加(p＜0.01)。
　　PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染p53 si

7、RNA使p53蛋白有效沉默，以及轉(zhuǎn)染p53過(guò)表達(dá)質(zhì)粒使p53蛋白過(guò)表達(dá)，運(yùn)用Western blot法鑒定p53干擾效率，并通過(guò)p53免疫熒光確定p53蛋白的亞細(xì)胞定位。將黏菌素作用于PC12細(xì)胞12h或24h，試驗(yàn)設(shè)立空白組、colistin(12 h、24 h)組、colistin+negative control(NC)(12 h、24 h)組、colistin+sip53(12 h、24 h)組、colistin+pcDNA3.

8、1(12h、24 h)組和colistin+pcDNA3.1+p53(12 h、24 h)組，采用上述實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)細(xì)胞自噬和凋亡的相關(guān)基因和蛋白表達(dá)量變化，結(jié)合形態(tài)學(xué)變化和一系列生化指標(biāo)改變，分析并探討p53基因沉默及過(guò)表達(dá)在黏菌素誘導(dǎo)自噬過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制;再分別使用100 nM溶酶體抑制劑(BFA)和5mM自噬抑制劑(3-MA)分別將細(xì)胞做預(yù)處理，檢測(cè)自噬和凋亡的標(biāo)志性蛋白表達(dá)的指標(biāo)及細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，以分析和評(píng)定p53基因表達(dá)量變化對(duì)

9、自噬功能的影響。
　　試驗(yàn)結(jié)果表明:
　　(1)與陰性對(duì)照組相比（colistin+NC; colistin+pcDNA3.1），Western blot和p53免疫熒光的檢測(cè)結(jié)果顯示，p53 siRNA和pcDNA3.1+p53能有效地沉默和過(guò)表達(dá)細(xì)胞質(zhì)中的p53基因。
　　(2)與陰性對(duì)照組相比(colistin+NC)，在黏菌素誘導(dǎo)的p53基因沉默組PC12細(xì)胞中，12h時(shí)間點(diǎn)自噬相關(guān)基因和蛋白表達(dá)量明顯降低(p

10、＜0.01)，LC3免疫熒光點(diǎn)減弱，電鏡下觀察自噬小體減少;24h時(shí)間點(diǎn)自噬相關(guān)基因和蛋白表達(dá)量顯著增加(p＜0.01)，LC3免疫熒光點(diǎn)增加，電鏡下觀察自噬小體增多。
　　(3)與colistin+sip53組相比，colistin+sip53+BFA組自噬通量指標(biāo)無(wú)顯著變化:colistin+sip53+3-MA組凋亡相關(guān)活性蛋白表達(dá)量顯著降低(p＜0.01)，細(xì)胞核固縮、偏移現(xiàn)象減少。
　　(4)與陰性對(duì)照組相比(co

11、listin+pcDNA3.1)，在黏菌素誘導(dǎo)的p53基因過(guò)表達(dá)組PC12細(xì)胞中，自噬相關(guān)基因和蛋白表達(dá)量明顯降低(p＜0.01)并呈現(xiàn)時(shí)間依賴性，LC3免疫熒光點(diǎn)減弱，電鏡下觀察自噬小體明顯減少;凋亡相關(guān)活性蛋白及基因的表達(dá)量顯著降低(p＜0.01)，細(xì)胞核固縮、偏移現(xiàn)象明顯。
　　綜上所述，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)JNK信號(hào)通路在黏菌素誘導(dǎo)自噬機(jī)制的初探，發(fā)現(xiàn)JNK參與黏菌素誘導(dǎo)的自噬，JNK-Bcl2-Bax信號(hào)通路調(diào)節(jié)黏菌素誘導(dǎo)的細(xì)胞