Notch信號通路在肺成纖維細胞表型轉(zhuǎn)化中的作用及機制研究.pdf

1、目的：探討γ-分泌酶抑制劑DAPT抑制Notch信號前后，在肺成纖維細胞中Notch信號通路受體Notch1、配體Jagged1及肌成纖維細胞標(biāo)志因子α-SMA表達的變化，研究Notch信號通路在肺成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化中的作用。
　　 方法：采用胰酶消化法，從新出生2-3天的S-D大鼠肺組織中分離培養(yǎng)肺成纖維細胞，波形蛋白(Vimentin)免疫細胞化學(xué)法鑒定培養(yǎng)至第三代的成纖維細胞的純度，無血清培養(yǎng)基同步24h，再將細

2、胞分為對照組、TGF-β1組、TGF-β1+DAPT組；TGF-β1組及TGF-β1+DAPT組加入5ng/ml的TGF-β1誘導(dǎo)成纖維細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，TGF-β1+DAPT組同時加入500nmol/l的DAPT抑制Notch信號的表達；分別采用免疫細胞化學(xué)法檢測α-SMA蛋白的表達變化，RT-PCR法檢測Notch1、Jagged1和α-SMA mRNA的表達變化，Western-blot法檢測Notch1、Jagged1和α

3、-SMA蛋白的表達變化；采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。
　　 結(jié)果：(1)Vimentin免疫細胞化學(xué)：幾乎100％細胞胞漿內(nèi)可見棕褐色顆粒及條紋，證明胰酶消化法培養(yǎng)至第三代的幾乎全為成纖維細胞；(2)α-SMA免疫細胞化學(xué)：未加藥物干預(yù)的對照組細胞中少部分細胞內(nèi)有淡黃色顆粒及條紋，TGF-β1組大部分細胞內(nèi)有黃色和黃褐

4、色顆粒及條紋，TGF-β1+DAPT組部分細胞內(nèi)有淡黃色顆粒及條紋；(3)α-SMAmRNA和蛋白表達：TGF-β1組α-SMA的mRNA和蛋白的相對吸光度值(0.851±0.027和0.785±0.020)較對照組(0.395±0.018和0.391±0.022)和TGF-β1+DAPT組(0.354±0.029和0.397+0.016)顯著升高，但對照組與TGF-β1+DAPT組比較則差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；(4)Notc

5、h1 mRNA和蛋白表達：TGF-β1組Notch1 mRNA和蛋白相對吸光度值分別為0.783±0.018和0.701±0.026，較對照組(0.278±0.022和0.312±0.019)和TGF-β1+DAPT組(0.313±0.029和0.345±0.022)明顯升高，而對照組和TGF-β1+DAPT組相比較則差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；(5)Jagged1mRNA和蛋白表達：TGF-β1組Jagged1 mRNA和蛋白相

6、對吸光度值(0.851±0.028和0.847±0.026)較對照組(0.392±0.021和0.394±0.027)和TGF±β1+DAPT組(0.404±0.024和0.409±0.026)升高顯著，對照組和TGF-β1+DAPT組相比較則差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)
　　 結(jié)論：胰酶消化法可培養(yǎng)出肺成纖維細胞。TGF-β1可以誘導(dǎo)肺成纖維細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，轉(zhuǎn)化過程中Notch1、Jagged1和α-SMA mRN