富組蛋白1促進(jìn)人表皮細(xì)胞、人成纖維細(xì)胞增殖和遷移在創(chuàng)作愈合中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景
　　 口腔黏膜創(chuàng)傷較皮膚創(chuàng)傷愈合速度快，瘢痕少，是一種理想的愈合形式，此現(xiàn)象歸因于口腔黏膜本身的組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及特殊的唾液環(huán)境。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)唾液中的抗菌肽成分-富組蛋白能夠促進(jìn)口腔黏膜上皮細(xì)胞遷移，是口腔黏膜創(chuàng)傷愈合的主要影響因子。抗菌肽屬天然免疫防御系統(tǒng)成員，目前研究發(fā)現(xiàn)其某些成員具有抵抗病原微生物以及促創(chuàng)傷愈合的雙重功能，是一類極具應(yīng)用前景的新型創(chuàng)傷治療藥物。由于特異性表達(dá)于人類及靈長(zhǎng)類動(dòng)物唾液，富組蛋白能否影響皮

2、膚創(chuàng)傷愈合尚不清楚，研究甚少。
　　 研究目的
　　 本研究以皮膚創(chuàng)傷愈合相關(guān)細(xì)胞：人表皮HaCaT細(xì)胞株、人成纖維細(xì)胞株為研究對(duì)象，考察富組蛋白1(Histatin1，Hst1)對(duì)兩者增殖和遷移功能的影響，并初步探討其作用機(jī)制，旨在探明唾液特有抗菌肽Hst1對(duì)非口腔黏膜細(xì)胞的有無(wú)影響，能否促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合，為促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合提供新的治療思路。
　　 研究方法
　　 人表皮HaCaT細(xì)胞株、人成纖維細(xì)胞株

3、按常規(guī)方法培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。
　　 1.采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法、MTT比色法考察不同濃度(3～100μg/mL)Hst1于不同時(shí)相點(diǎn)(24 h、48 h、72 h)對(duì)人表皮HaCaT細(xì)胞株、人成纖維細(xì)胞株增殖功能的影響，并對(duì)其與人重組表皮生長(zhǎng)因子(rhEGF)的相互作用關(guān)系進(jìn)行比較。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同作用時(shí)相點(diǎn)不同濃度Hst1對(duì)兩種細(xì)胞周期的影響，初步探討其促增殖機(jī)制。
　　 2.利用體外細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，考察

4、不同時(shí)相點(diǎn)，絲裂霉素C(MMC)處理后或未處理時(shí)Hst1和(或)rhEGF對(duì)人表皮HaCaT細(xì)胞株、人成纖維細(xì)胞株劃痕創(chuàng)傷愈合率的影響。
　　 3.采用MTT法、體外細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，考察EGFR，TGFBRⅡ，Syndencan-1及Syndencan-4四種細(xì)胞表面受體抗體對(duì)Hst1作用下人表皮HaCaT細(xì)胞株、人成纖維細(xì)胞株增殖、遷移功能的影響。
　　 4.數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，組間比較采用LS

5、D-t檢驗(yàn)或Dunnett's T3檢驗(yàn)。
　　 研究結(jié)果
　　 1.3μg/mL～100μg/mL Hst1能夠促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖，且與濃度、時(shí)間呈依賴關(guān)系。
　　 (1)細(xì)胞培養(yǎng)后24 h，僅10 ng/mL thEGF組、30μg/mL Hst1+10 ng/mL rhEGF組細(xì)胞數(shù)高于對(duì)照組(t=3.813，5.410，P<0.05或P<0.01)。除培養(yǎng)后48 h30μg/mL Hst1組、3μg/

6、mL Hst1組外，其余各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)細(xì)胞后48 h、72 h，細(xì)胞數(shù)均顯著高于對(duì)照組(t值為7.754～24.979，P<0.01)。培養(yǎng)后72 h，100μg/mL Hst1組細(xì)胞數(shù)(19.21±0.59)×104個(gè)明顯高于30μg/mL Hst1組(16.19±0.53)×104個(gè)以及3μg/mL Hst1組(15.38±0.13)×104個(gè)(t=11.391，19.017，P<0.01)，30μg/mL Hst1+10 ng/mL

7、 rhEGF組細(xì)胞數(shù)(19.75±0.35)×104個(gè)高于30μg/mL Hst1組，3μg/mL Hst1組及10 ng/mL rhEGF組(19.19±0.09)×104個(gè)(t值為4.579～34.884，P<0.05或P<0.01)。各濃度Hst1單獨(dú)作用組培養(yǎng)細(xì)胞后24 h～72 h內(nèi)，細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加(t值為16.629～68.891，P<0.01)。
　　 (2)細(xì)胞培養(yǎng)后24 h～72 h內(nèi)，各濃度Hst1組

8、OD值均高于同一時(shí)相點(diǎn)對(duì)照組(t值為3.160～15.576，P<0.01或P<0.05)。同一時(shí)相點(diǎn)不同濃度Hst1組OD值隨濃度降低而下降，24 h～72 h內(nèi)100μg/mL Hst1組OD值均顯著高于3μg/mL Hst1組(t值為4.264～7.234，P<0.01)。各濃度Hst1組細(xì)胞培養(yǎng)后72 h、48 hOD值均高于培養(yǎng)后24 h同組內(nèi)OD值(t值為6.219～22.308，P<0.01)。
　　 (3)細(xì)胞培

9、養(yǎng)后24 h，48 h，100μg/mL Hst1組(0.62±0.01，0.70±0.01)、30μg/mLHst1組(0.52±0.01，0.66±0.01)與對(duì)照組PI值(0.48±0.01，0.54±0.01)比較均顯著提高(t值為4.752～16.104，P<0.01)。細(xì)胞培養(yǎng)24 h～72 h內(nèi)，除72 h30μg/mL Hst1組與3μg/mL Hst1組PI值比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外(t=0.273，P>0.05)，各濃度H

10、st1處理組比較，隨濃度增加PI值均明顯提高(t值為3.690～17.459，P<0.01)。同濃度Hst1處理組組內(nèi)48 h PI值較24 h明顯增加(t值為7.607～15.582，P<0.01)，72 h較48 h則明顯降低(t值為-29.672～-18.657，P<0.01)。
　　 2.30μg/mL Hst1能夠促進(jìn)HaCaT細(xì)胞劃痕創(chuàng)傷愈合。MMC未處理時(shí)：細(xì)胞劃痕加藥處理后16 h，30μg/mL Hstl組細(xì)胞

11、愈合率(75.87±3.94)%顯著高于對(duì)照組(52.98±3.50)%(t=12.241，P<0.01)，但低于30μg/mL Hst1+10 ng/mL rhEGF組(94.98±4.08)%、15μg/mL Hst1+5 ng/mL rhEGF(97.05±3.67)%、15μg/mL Hst1+10ng/mL thEGF組(80.55±5.94)%(t值為-11.324～-2.502，P<0.01或P<0.05)。各組內(nèi)劃痕后2

12、4 h與16 h比較，細(xì)胞16 h愈合率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值為0.990～1.771，P>0.05)。
　　 MMC處理后：劃痕后16 h，30μg/mL Hst1組細(xì)胞愈合率(59.89±3.41)%高于對(duì)照組(38.40±4.22)%(t=7.790，P<0.01)，但較MMC未處理時(shí)30μg/mL Hst1組明顯下降(t=-10.863，P<0.01)。Hst1與thEGF聯(lián)合應(yīng)用組16 h劃痕愈合率與30μg/mL H

13、st1組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t值為0.0614～2.030，P>0.05)。各組內(nèi)劃痕24 h與16 h比較，細(xì)胞愈合率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值為0.925～1.750，P>0.05)。
　　 3.3μg/mL～100μg/mL Hst1的Hst1能夠促進(jìn)人成纖維細(xì)胞增殖。
　　 (1)細(xì)胞培養(yǎng)后24 h～72 h內(nèi)，各濃度Hstl組細(xì)胞數(shù)較同一時(shí)相點(diǎn)對(duì)照組均增長(zhǎng)(t值為4.062～47.370，P<0.01或P<0.05)

14、。細(xì)胞培養(yǎng)后24 h，100μg/mL Hst1組細(xì)胞數(shù)(3.89±0.18)×104個(gè)較3μg/mL組(3.13±0.53)×104個(gè)提高(t=4.040，P<0.05)；培養(yǎng)后48 h，30μ9/mL Hst1組(5.02±0.71)×104個(gè)，3μg/mL組(5.00±0.35)×104個(gè)細(xì)胞數(shù)較100μg/mL Hst1組(4.13±0.18)×104個(gè)提高(t=3.661，6.680，P<0.05或P<0.01)；培養(yǎng)后72

15、h，30μg/mL Hst1組細(xì)胞數(shù)(12.37±0.18)×104個(gè)較100μg/mL Hst1組(9.50±0.71)×104個(gè)，3μg/mL組(10.13±1.24)×104個(gè)明顯提高(t=11.808，5.349，P<0.01)。各濃度Hst1組培養(yǎng)細(xì)胞后24 h～72 h內(nèi)，細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間延長(zhǎng)而增長(zhǎng)(t值為2.854～30.055，P<0.01或P<0.05)。同一時(shí)相點(diǎn)，30μg/mL Hst1+10 ng/mL thEGF組

16、較單一使用Hst1或rhEGF相比細(xì)胞數(shù)均顯著增加(t值為3.857～20.045，P<0.01)。
　　 (2)細(xì)胞培養(yǎng)后24 h～72 h內(nèi)，各濃度Hst1組OD值均顯著高于同一時(shí)相點(diǎn)對(duì)照組(t值為3.712～18.262，P<0.01)。細(xì)胞培養(yǎng)后24 h，100μg/mL Hst1組(0.50±0.02)較30μg/mL Hst1組(0.47±0.02)，30μg/mL Hst1組較3μg/mL Hst1組(0.42±0

17、.03)OD值均顯著增加(t=3.187，5.036，P<0.01)；培養(yǎng)后48 h各濃度組間OD值比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t值為1.279～2.375，P>0.05)；培養(yǎng)后72 h，與30μg/mL Hst1組(0.79±0.04)比較，100μg/mL Hst1組(0.70±0.04)，3μg/mL組(0.62±0.03)OD值均明顯降低(t=-6.484，-7.512，P<0.01)。對(duì)照組及各濃度Hst1組同組內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞后24 h～

18、72 h內(nèi)，OD值隨時(shí)間延長(zhǎng)顯著增長(zhǎng)(t值為4.298～25.956，P<0.01)。
　　 (3)細(xì)胞培養(yǎng)后24 h，100μg/mL Hst1組(0.16±0.01)、30μg/mL Hst1組(0.16μ0.01)PI值高于對(duì)照組(0.12±0.01)(t=6.790，6.052，P<0.01)。培養(yǎng)后48 h，各濃度Hst1組PI值均高于對(duì)照組(t值為5.497～20.927，P<0.01)；培養(yǎng)后72 h，各濃度Hst

19、1組PI值與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=2.583，P>0.05)。
　　 細(xì)胞培養(yǎng)后24 h，100μg/mL Hst1組PI值較30μg/mL Hst1組，30μg/mL Hst1組較3μg/mL Hst1組提高(t=7.662，5.828，P<0.01或P<0.05)。培養(yǎng)后48 h，30μg/mL Hst1組PI值較100μg/mL Hst1組、3μg/mL Hst1組明顯增加(t=11.875，15.430，P<0.0

20、5)。培養(yǎng)后72 h各濃度Hst1組間PI值比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=3.909，P>0.05)。各濃度Hst1組培養(yǎng)后48 h較培養(yǎng)后24 h、72 h組內(nèi)PI值顯著提高(t值為5.688～26.912，P<0.01)
　　 4.30μg/mL Hst1能促進(jìn)HF細(xì)胞劃痕創(chuàng)面愈合。MMC未處理時(shí)：細(xì)胞劃痕加藥處理后8h，30μg/mL Hst1組劃痕愈合率(37.50±2.22)%顯著高于對(duì)照組(26.00±5.60)%(t=6.

21、037，P<0.01)，低于15μg/mLHst1+10 ng/mLrhEGF組愈合率(45.24±3.26)%(t=-6.170，P<0.05)。
　　 MMC處理HF后，各實(shí)驗(yàn)組8h愈合率兩兩比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=1.822，P>0.05)。MMC處理或未處理相同成分及濃度對(duì)應(yīng)組相比，各組8h愈合率顯著下降(F值為-12.067～-5.824，P<0.01)。
　　 隨著時(shí)間延長(zhǎng)，劃痕愈合速度減慢，同組內(nèi)16 h與

22、8h劃痕愈合率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F值為0.442～4.121，P>0.05)。
　　 5.EGFR，TGFβRⅡ，Syndencan-1及Syndencan-4四種受體抗體均能抑制Hst1對(duì)HaCaT細(xì)胞的增殖、遷移促進(jìn)作用。
　　 細(xì)胞加抗體處理后24 h～72 h，各抗體組較30μg/mL Hst1組OD值下降(t值為3.424～34.583，P<0.05或P<0.01)。
　　 四種受體抗體處理細(xì)胞后細(xì)胞

23、劃痕愈合率降低，各抗體組16h愈合率[(41.15±0.95)%，(53.15±2.07)%，(46.24±2.51)%，(47.06±1.33)%]較30μg/mL Hst1組(71.02±2.42)%下降(t值為-36.333～-17.724，P<0.01)。其中，EGFR抗體組16 h愈合率顯著低于其余三種受體抗體(t值為-16.644～-6.000，P<0.01)。HaCaT細(xì)胞經(jīng)MMC處理排除增殖后，各抗體組16 h愈合率[(

24、34.05±0.96)%，(45.76±2.02)%，(2.31±0.23)%，(4.75±0.36)%]較30μg/mLHst1組(50.41±1.17)%下降，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t值為-127.235～-6.284，P<0.01)。其中，Syndencan-1，Syndencan-4受體抗體組愈合率均顯著低于其余兩種受體抗體組(t值為-102.068～-63.082，P<0.01)。
　　 6.Syndecan-4抗體能抑制

25、Hst1對(duì)HF的增殖促進(jìn)作用。細(xì)胞加抗體處理后24 h～72 h，Syndecan-4抗體組OD值[(0.37±0.03)，(0.53±0.03)，(0.64±0.03)]較30μg/mL Hst1組[(0.50±0.02)，(0.65±0.03)，(0.72±0.04)]顯著下降(t值為2.868～11.462，P<0.01)。
　　 細(xì)胞加四種受體抗體后Syndecan-4抗體組(21.83±2.19)%較30μg/mL H

26、st1組16 h細(xì)胞劃痕愈合率(31.23±2.66)%顯著降低(t=7.132，P<0.01)，且低于其余三種抗體組愈合率(r值為5.209～5.315，P<0.01)。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，劃痕愈合速度減慢，同組內(nèi)16 h與8h劃痕愈合率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值為0.184～1.242，P>0.05)。
　　 研究結(jié)論
　　 1.Hst1能夠促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖和遷移，其促增殖作用與濃度、時(shí)間呈依賴關(guān)系。Hst1與thEG

27、F聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖和劃痕創(chuàng)傷愈合具有協(xié)同促進(jìn)作用，而對(duì)遷移功能無(wú)明顯協(xié)同作用。
　　 2.Hst1能夠促進(jìn)人成纖維細(xì)胞增殖，但促遷移功能不明顯。Hst1與rhEGF聯(lián)合使用時(shí)對(duì)人成纖維細(xì)胞增殖和劃痕創(chuàng)傷愈合具有協(xié)同促進(jìn)作用。
　　 3.EGFR，TGFβRⅡ，Syndencan-1及Syndencan-4可能均與Hst1促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖、遷移有關(guān)，其中，Syndencan-1，Syndencan-4與