克羅諾桿菌屬O抗原分型系統(tǒng)的建立及多樣性形成機(jī)制研究.pdf

1、克羅諾桿菌屬是最近新分類的一個(gè)屬，目前包括7個(gè)命名的種-Cronobacter sakazakii，C.malonaticus，C.muytjensii，C.dublinensis，C。turicensis，C.condimenti，和C.universalis。克羅諾桿菌屬是一種重要的食源性致病菌，在多種食物中均分離到該屬菌株?？肆_諾桿菌屬可導(dǎo)致任何年齡層人群的疾病，尤其是免疫力低下的嬰幼兒和老人，能夠引起嚴(yán)重的壞死性小腸結(jié)腸炎、敗血

2、癥和腦膜炎。盡管感染率低，但治愈率低且致死性強(qiáng)(在受感染的兒童中死亡率可高達(dá)33％-80%)，已導(dǎo)致多起的腦膜炎和壞死性腸炎的散發(fā)和暴發(fā)。除C.universalis，其他6種克羅諾桿菌屬都有臨床感染的報(bào)道。C.sakazakii因其在臨床上分離的最多，臨床意義大而成為Cronobacter屬中最重要的一種菌。
　　 O抗原是熱穩(wěn)定抗原，位于革蘭氏陰性菌表面，是脂多糖的重要組分。O抗原具有很強(qiáng)的免疫原性并且是一些噬菌體的作用位點(diǎn)

3、，這些因素使其受到較強(qiáng)的選擇壓力并導(dǎo)致O抗原具有高度的多樣性。O抗原重復(fù)單元是高度變化的，這為革蘭氏陰性細(xì)菌的血清分型提供基礎(chǔ)。負(fù)責(zé)O抗原合成的基因簇通常位于細(xì)菌染色體特定位置，O抗原的多樣性主要是由于O抗原基因簇的遺傳學(xué)多樣性造成的。O抗原基因簇中的基因可以被分為3類：?jiǎn)翁呛铣擅富?、糖基轉(zhuǎn)移酶基因和寡糖單位處理酶基因。
　　 血清學(xué)分型為細(xì)菌分類奠定了基礎(chǔ)，其在細(xì)菌的流行病學(xué)調(diào)查和預(yù)防控制方面具有重要的意義。目前，克羅諾桿菌

4、屬的O抗原分型信息很少。在本研究中，我們對(duì)從不同分離地搜集到的134株Cronobacter菌株進(jìn)行了鑒定，其中119株菌鑒定為C.sakazakii菌株，基于這119株C.sakazakii菌株，我們建立了一套血清學(xué)分型方法，將這119株菌分為7種血清型(O1-O7)。7種血清的效價(jià)都高達(dá)640。O2和O6血清較特異，O4血清和O1抗原、O7血清和O6抗原之間有非特異性凝集反應(yīng)，O1、O3和O5類似一個(gè)血清群，彼此之間均有交叉反應(yīng)，需

5、要相互吸收才能得到特異的血清型血清。所有的119株C.sakazakii菌都分到了這7個(gè)血清型中，其中O1和O2血清型包含的菌株最多，占到菌株總數(shù)的69.7%。我們同時(shí)對(duì)C.sakazakii的O抗原基因簇進(jìn)行了限制性酶切多態(tài)性分析(RFLP)，結(jié)果顯示，RFLP的分型結(jié)果與血清的分型結(jié)果完全一致，這也進(jìn)一步證明了血清學(xué)分型系統(tǒng)是準(zhǔn)確的。本研究建立的C.sakazakii的血清學(xué)分型系統(tǒng)將為克羅諾桿菌屬的菌株分型提供基礎(chǔ)。
　　

6、 本研究還針對(duì)整個(gè)克羅諾桿菌屬的O抗原進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。在本研究中，我們確定了克羅諾桿菌屬的12個(gè)新的O血清型，分別為C.sakazakii O3-O7血清型、C.dublinensis O1-O3血清型、C.turicensis O2-O3血清型、C.muytjensii O2血清型和C.malonaticus O1血清型。并完成了這些血清型的O抗原基因簇的破譯和10個(gè)O抗原結(jié)構(gòu)解析。從整體上分析了克羅諾桿菌屬O抗原基因簇的基本特征和

7、特殊特征，深入分析O抗原結(jié)構(gòu)和O抗原基因簇之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，并預(yù)測(cè)了部分罕見單糖的合成途徑。本研究發(fā)現(xiàn)，某些克羅諾桿菌屬的O抗原基因簇與大腸桿菌相似，例如C.malonaticus O1和E.coli O29，C.sakazakii O4和E。coli0103之間，并且這些O抗原內(nèi)部的基因的相似性明顯低于克羅諾桿菌屬和大腸桿菌持家基因之間的相似性，這意味著O抗原承受更大的選擇壓力。此外，分析顯示在克羅諾桿菌屬屬的不同種之間，存在著5對(duì)相似

8、的O抗原基因簇，這意味著這些共享的O抗原類型可能具有共同的祖先并隨著種分化而分化形成，這些O抗原類型可能更適應(yīng)克羅諾桿菌屬的生存環(huán)境。本研究在獲得克羅諾桿菌屬O抗原基因簇序列的基礎(chǔ)上，篩選獲得了克羅諾桿菌屬O抗原特異基因，并建立了基于特異PCR的克羅諾桿菌屬O血清型分型系統(tǒng)，特異引物保守性、特異性和靈敏度試驗(yàn)的結(jié)果顯示，篩選到底特異引物準(zhǔn)確、特異，DNA靈敏度可達(dá)到0.01ng，純菌靈敏度達(dá)到103CFU。
　　 總之，本研究首