阪崎克羅諾桿菌菌膜形成相關(guān)基因的篩選鑒定.pdf

1、阪崎克羅諾桿菌能引起嚴(yán)重的新生兒腦膜炎、菌血癥、小腸結(jié)腸炎，并可能引起神經(jīng)功能紊亂，造成嚴(yán)重的后遺癥，死亡率高達(dá)20％-50％，引起世界范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)嬰兒配方奶粉是其主要的感染源。菌膜形成是細(xì)菌對(duì)抗不利環(huán)境的一種自我保護(hù)機(jī)制。在形成菌膜后，菌體對(duì)外界各種理化因子的耐受力會(huì)大大增加。在阪崎克羅諾桿菌的菌膜形成中，纖維素合成的相關(guān)基因、鞭毛的形成和功能基因均起到了非常重要的作用。然而，目前關(guān)于阪崎克羅諾桿菌的菌膜形成機(jī)制仍然

2、不清楚。
　　本研究首先利用結(jié)晶紫染色法，對(duì)23株食源性阪崎克羅諾桿菌菌膜形成能力進(jìn)行檢測(cè)，從中篩選出1株菌膜形成能力最強(qiáng)的菌株。再利用電轉(zhuǎn)化法，將EZ-TN5轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)入到這株阪崎克羅諾桿菌中，構(gòu)建了轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變庫(kù)，共獲得430株突變株。隨后利用結(jié)晶紫法對(duì)430株突變株的菌膜形成能力進(jìn)行檢測(cè)，篩選出菌膜形成能力較野生型菌株均降低40％以上的突變株12株。利用IPCR(反向PCR)和Tail-PCR（交錯(cuò)式熱不對(duì)稱(chēng)PCR）的方法對(duì)

3、這12株突變株中EZ-TN5轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列進(jìn)行擴(kuò)增，最終成功測(cè)序出8個(gè)目的基因序列，BLAST同源性比對(duì)結(jié)果顯示這8個(gè)基因可能編碼的蛋白分別為:hypotheticalproteinCTU_14280、aldehydereductase、phosphopentomutase、lipoproteinNlpD、argininosuccinatesynthase、phagetailproteinR(GpR)和excinuclease

4、ABCsubunitA。利用Southern雜交的方法證實(shí)了這8個(gè)突變株基因組DNA中均只含有一個(gè)轉(zhuǎn)座子序列，從而證明這些基因與菌膜形成的相關(guān)性。通過(guò)對(duì)阪崎克羅諾桿菌野生型和菌膜突變株生長(zhǎng)曲線的對(duì)比分析可知，突變后的菌株生長(zhǎng)速率并未明顯改變，證明菌膜形成降低并不是由于菌體生長(zhǎng)受到抑制造成的。利用掃描電鏡對(duì)野生株和突變株形成的菌毛進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示野生型可以形成較厚的菌膜，而突變株只能形成一層較弱的胞外聚合物，進(jìn)一步證實(shí)了這些基因與菌膜形