不同體外培養(yǎng)體系對(duì)胚胎發(fā)育的影響.pdf

1、胚胎質(zhì)量是影響體外受精(in vitro fertilization,IVF)結(jié)局的重要因素。而胚胎在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中所處的局部微觀環(huán)境對(duì)胚胎質(zhì)量發(fā)揮著決定性作用。胚胎培養(yǎng)微環(huán)境最主要的構(gòu)成部分就是體外培養(yǎng)體系。如何建立最適宜胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的體外培養(yǎng)體系,是目前輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technologies,ART)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。
　　 近些年來(lái),隨著對(duì)培養(yǎng)微環(huán)境研究的進(jìn)一步深入和認(rèn)識(shí)的逐漸

2、加深,體外培養(yǎng)體系被不斷地改良更新。目前主要采用的是礦物油或者石蠟油覆蓋的微滴培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)胚胎。國(guó)內(nèi)外許多研究證實(shí)哺乳動(dòng)物胚胎體外培養(yǎng)時(shí),群組法培養(yǎng)要比單胚法培養(yǎng)獲得更高質(zhì)量的胚胎。然而發(fā)生機(jī)制仍然不清,可能與胚胎發(fā)育過(guò)程中自身分泌因子的相互作用有關(guān)。然而這些研究大多是數(shù)十年前進(jìn)行的,最近幾年培養(yǎng)基和培養(yǎng)體系都有了很大幅度的更新,體外培養(yǎng)胚胎質(zhì)量和妊娠結(jié)局得到很大的改善。在現(xiàn)有的新培養(yǎng)條件下,體外受精胚胎是單獨(dú)培養(yǎng)或還是群組培養(yǎng),胚胎質(zhì)

3、量是否會(huì)受到培養(yǎng)體積和密度的影響等依然不明。
　　 盡管數(shù)量眾多的胚胎群組共同培養(yǎng)可能有助于胚胎發(fā)育,但這僅僅是用于實(shí)驗(yàn)研究,并且群組培養(yǎng)無(wú)法追蹤個(gè)體胚胎的發(fā)育情況。商業(yè)化的培養(yǎng)系統(tǒng)或者人胚培養(yǎng)系統(tǒng)多要求胚胎單獨(dú)培養(yǎng)或者小數(shù)量胚胎群組培養(yǎng)。為了克服這些問(wèn)題,Vaita等開(kāi)發(fā)了微孔(the-well-of-the-well,WOW)培養(yǎng)系統(tǒng),為單獨(dú)培養(yǎng)的胚胎提供了半開(kāi)放的培養(yǎng)微環(huán)境。微孔培養(yǎng)系統(tǒng)不僅稀釋了胚胎發(fā)育過(guò)程中堆積的代謝產(chǎn)

4、物的毒性作用,而且還將胚胎自分泌或者旁分泌的生長(zhǎng)因子聚集在每個(gè)微孔內(nèi)的胚胎周?chē)?進(jìn)而促進(jìn)胚胎發(fā)育。目前關(guān)于微孔系統(tǒng)應(yīng)用于胚胎培養(yǎng)的研究相對(duì)較少,并且多集中于單微滴多微孔多胚胎培養(yǎng)研究,單微滴單微孔單胚胎培養(yǎng)未見(jiàn)報(bào)道,特別是對(duì)于超微滴體積下微孔培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)于胚胎發(fā)育的影響、微孔培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)玻璃化冷凍前后胚胎細(xì)胞凋亡的影響未見(jiàn)報(bào)道。
　　 從卵巢中獲取未成熟卵,在體外適宜的微環(huán)境和培養(yǎng)條件下培養(yǎng)成熟,從而具備受精和胚胎發(fā)育能力,即為卵母

5、細(xì)胞體外成熟(in vitro maturation,IVM)技術(shù)?；A(chǔ)研究和臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn),IVM來(lái)源的胚胎質(zhì)量差,囊胚形成率低,植入能力下降,妊娠結(jié)局欠佳。究其原因,可能與卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)胞核和胞漿成熟不同步、卵子質(zhì)量較差有關(guān)。在研究中發(fā)現(xiàn),卵母細(xì)胞和其周?chē)念w粒細(xì)胞通過(guò)內(nèi)分泌、自分泌、旁分泌的方式相互影響,相互作用。顆粒細(xì)胞分泌一些可溶性的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)胞核和胞質(zhì)的成熟。是否可以利用WOW系統(tǒng)體外培養(yǎng)未成熟卵子以提高卵子質(zhì)量依然不

6、明確,相關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道。
　　 微滴法群組培養(yǎng)有利于提高胚胎的發(fā)育潛能,但是該培養(yǎng)方法無(wú)法追蹤胚胎的個(gè)體發(fā)育,同時(shí)過(guò)高的胚胎密度也容易導(dǎo)致代謝產(chǎn)物的堆積而增加培養(yǎng)微滴的毒性。微孔系統(tǒng)培養(yǎng)仍處于實(shí)驗(yàn)研究階段,培養(yǎng)條件仍需要摸索。而且目前商品化的微孔培養(yǎng)用皿形式單一、規(guī)模較小,因此大多數(shù)生殖中心仍選擇單胚微滴法培養(yǎng)人的胚胎。傳統(tǒng)的單胚微滴法培養(yǎng)面臨著很多挑戰(zhàn),長(zhǎng)時(shí)間的精卵孵育可以導(dǎo)致許多毒性物質(zhì)的堆積,阻礙早期胚胎的發(fā)育。許多研究提

7、出,IVF技術(shù)改良之一的選擇就是縮短受精時(shí)間,從16-18小時(shí)縮短至1-4小時(shí)。對(duì)于縮短精卵共孵育時(shí)間是否有利于胚胎發(fā)育仍存在爭(zhēng)議。
　　 本研究通過(guò)改變小鼠早期胚胎在微滴培養(yǎng)系統(tǒng)中的微滴體積、胚胎密度觀察評(píng)估胚胎發(fā)育結(jié)局;微孔培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)早期胚胎獲得囊胚行玻璃化冷凍,觀察冷凍前后囊胚細(xì)胞凋亡率的變化并評(píng)估技術(shù)安全性;微孔系統(tǒng)培養(yǎng)未成熟卵子并進(jìn)行后續(xù)胚胎培養(yǎng),觀察評(píng)估微孔系統(tǒng)對(duì)卵子和胚胎的發(fā)育潛能的影響;人胚胎單胚培養(yǎng)系統(tǒng)中縮短

8、精卵共孵育時(shí)間觀察胚胎發(fā)育和妊娠結(jié)局等探索不同的體外培養(yǎng)體系對(duì)胚胎發(fā)育的影響。經(jīng)查新未見(jiàn)相同報(bào)道。
　　 第一部分:不同體積和胚胎密度的微滴和微孔培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)早期鼠胚發(fā)育的影響
　　 研究目的:
　　 探討早期小鼠2細(xì)胞胚胎的最佳培養(yǎng)微滴體積和胚胎密度,并評(píng)估胚胎共培養(yǎng)時(shí)間以及WOW培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)胚胎質(zhì)量的影響研究方法:
　　 (1)9個(gè)/微滴2細(xì)胞鼠胚分別在6.25、12.50、25.00和50.00μl微滴

9、中培養(yǎng);(2)3、6、9和12個(gè)2細(xì)胞鼠胚在50μl微滴中培養(yǎng);(3)9個(gè)/微滴2細(xì)胞胚胎在50μl的微滴中共培養(yǎng)0h、24h、48h、72h、96h;(4)9個(gè)/微滴2細(xì)胞胚胎分別在50μl微滴和WOW系統(tǒng)中培養(yǎng),單個(gè)鼠胚分別在5.5μl的微滴和WOW系統(tǒng)中培養(yǎng)。(5)單個(gè)2細(xì)胞鼠胚在1、2、5.5μl體積的WOW系統(tǒng)中培養(yǎng)。所有分組比較囊胚形成率、孵出率和囊胚細(xì)胞數(shù)目。
　　 結(jié)果:
　　 9個(gè)2細(xì)胞胚胎在50μl微

10、滴中培養(yǎng)囊胚形成率最高(84.7％)。與群組培養(yǎng)相比,單個(gè)胚胎培養(yǎng)囊胚形成率降低。胚胎共培養(yǎng)72-96h囊胚形成率增高,96h囊胚率為84.7%。與微滴法相比,單個(gè)胚胎在WOW系統(tǒng)中培養(yǎng)囊胚形成率無(wú)明顯差異。但群組培養(yǎng)的囊胚細(xì)胞數(shù)目明顯高于單個(gè)胚胎培養(yǎng)。另外,單個(gè)胚胎在WOW中培養(yǎng)獲得囊胚細(xì)胞數(shù)目明顯高于微滴法。單WOW系統(tǒng)體中微滴積縮小至1-2μl,囊胚形成率未發(fā)明顯差異,但是囊胚孵出率、細(xì)胞總數(shù)明顯增高。
　　 結(jié)論:

11、>　　 50μl微滴9個(gè)2細(xì)胞胚胎是群組培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)體積/密度。胚胎共同培養(yǎng)超過(guò)72h有利于改善胚胎發(fā)育潛能。50μl的WOW系統(tǒng)能夠改善胚胎質(zhì)量并追蹤個(gè)體胚胎發(fā)育,但是仍不能克服單胚發(fā)育的缺陷。微滴體積減少至1μl時(shí)有助于提高單獨(dú)培養(yǎng)胚胎的發(fā)育潛能。
　　 第二部分:微孔培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)小鼠囊胚玻璃化冷凍前后的細(xì)胞凋亡影響和技術(shù)安全性評(píng)估
　　 研究目的:
　　 通過(guò)比較群組培養(yǎng)系統(tǒng)和單胚培養(yǎng)系統(tǒng)、微滴法和WOW

12、法獲得的囊胚玻璃化冷凍前后的凋亡率的比較來(lái)判斷WOW培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)胚胎質(zhì)量和冷凍耐受力的影響。
　　 研究方法:
　　 第一部分實(shí)驗(yàn)獲得群組培養(yǎng)、單胚培養(yǎng)、微滴法和WOW法的囊胚一部分行脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminal-deoxynucleotidyltransferase mediated nick end labeling,TUNEL)染色,另一部分囊胚行玻璃化冷凍,解凍復(fù)蘇后孵育3-4h、

13、6-8h、16-18h、24h,行TUNEL染色。比較細(xì)胞凋亡率。
　　 結(jié)果:
　　 單微滴群胚微孔培養(yǎng)法與其他各組相比,各發(fā)育階段囊胚細(xì)胞凋亡率明顯較低。群組法WOW系統(tǒng)和非-WOW系統(tǒng)擴(kuò)張期囊胚細(xì)胞凋亡率(10.3±3.0)%、(12.6±1.9)%明顯低于單胚培養(yǎng)組。解凍后完全擴(kuò)張少于8h的囊胚細(xì)胞凋亡率隨孵育時(shí)間延長(zhǎng)而無(wú)明顯變化。而完全擴(kuò)張延遲超過(guò)8h的囊胚在培養(yǎng)16-18h、24h后細(xì)胞凋亡率(14.2±1:

14、4.9)%、(14.2±3.3)%明顯增加。移植玻璃化冷凍解凍后的WOW法獲得的囊胚妊娠后出生小鼠體重各組無(wú)明顯差異。子代雌鼠獲卵數(shù)、IVF受精率、囊胚形成率、孵出率無(wú)明顯差別。
　　 結(jié)論:
　　 WOW培養(yǎng)系統(tǒng)有利于改善胚胎質(zhì)量和提高囊胚冷凍耐受力,囊胚解凍后完全擴(kuò)張延遲超過(guò)8h胚胎細(xì)胞凋亡率增加,胚胎發(fā)育潛能差。WOW法培養(yǎng)胚胎聯(lián)合玻璃化冷凍胚胎是安全有效的,對(duì)子代特別是雌鼠生殖能力無(wú)不良影響。
　　 第三

15、部分:顆粒細(xì)胞、成熟時(shí)間及微孔系統(tǒng)對(duì)卵子體外成熟及后續(xù)胚胎發(fā)育的影響
　　 研究目的:
　　 通過(guò)比較顆粒細(xì)胞、卵子成熟時(shí)間和體外培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)體外成熟卵子質(zhì)量、受精能力、胚胎發(fā)育潛能的影響,探討未成熟卵子體外成熟和后續(xù)胚胎發(fā)育的最佳培養(yǎng)微環(huán)境。
　　 研究方法:
　　 (1)240枚未成熟卵子隨機(jī)分為無(wú)顆粒細(xì)胞體外成熟組和有顆粒細(xì)胞體外成熟組,行體外成熟、受精、胚胎培養(yǎng);(2)282枚未成熟卵子分為24h培

16、養(yǎng)成熟組和48h培養(yǎng)成熟組,行體外受精和胚胎培養(yǎng);(3)259個(gè)未成熟卵子分為群組培養(yǎng)組(9個(gè)/微滴)和單獨(dú)培養(yǎng)組(1個(gè)/微滴),行體外成熟、受精、胚胎培養(yǎng)。(4)9個(gè)未成熟卵子及受精后的2細(xì)胞胚胎分別在50μl微滴和WOW系統(tǒng)中培養(yǎng),單個(gè)未成熟卵子及受精后的2細(xì)胞胚胎分別在5.5μl的微滴和WOW系統(tǒng)中培養(yǎng)。比較各組囊胚形成率、孵出率和囊胚細(xì)胞數(shù)目。
　　 結(jié)果:
　　 有顆粒細(xì)胞組卵子獲得胚胎囊胚形成率(34.0%)

17、和囊胚孵出率(72.2%)明顯高于無(wú)顆粒細(xì)胞組。經(jīng)24h培養(yǎng)成熟的卵子的胚胎卵裂率(64.6%)、囊胚形成率(37.5%)要明顯高于48h者。經(jīng)群組培養(yǎng)成熟的卵子與單卵培養(yǎng)成熟的卵子相比,成熟率(71.5%)、胚胎卵裂率(60.2%)、囊胚形成率(33.90%)要明顯增高。單胚培養(yǎng)組和群胚培養(yǎng)組相比,囊胚形成率明顯降低,而囊胚孵出率則無(wú)明顯差別。群胚培養(yǎng)時(shí),采用WOW系統(tǒng)的囊胚形成率、囊胚孵出率與非-WOW系統(tǒng)沒(méi)有明顯區(qū)別。WOW系統(tǒng)中

18、群組培養(yǎng)組的囊胚細(xì)胞總數(shù)為49.2±9.2,高于單胚培養(yǎng)組的38.2±8.0,在非-WOW系統(tǒng)中群組的43.0±7.7也高于單胚組的34.4±2.3。群組培養(yǎng)WOW系統(tǒng)囊胚細(xì)胞總數(shù)49.2±9.2明顯高于非.WOW系統(tǒng)中的43.0±7.7。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)TE細(xì)胞總數(shù)37.7±9.2)要明顯多于非.WOW系統(tǒng)31.7±7.3。此外,單胚培養(yǎng)WOW系統(tǒng)的囊胚細(xì)胞總數(shù)49.2±9.2)明顯多于非-WOW系統(tǒng)43.0±7.7。相應(yīng)的WOW系統(tǒng)的ICM

19、/TE(32.6±9.0)%也要高于非-WOW系統(tǒng)(36.8±6.6)%。
　　 結(jié)論:
　　 顆粒細(xì)胞有利于提高群組培養(yǎng)的卵子質(zhì)量改善胚胎發(fā)育潛能。卵子體外成熟時(shí)間超過(guò)24h胚胎質(zhì)量變差。卵子群組培養(yǎng)有利于提高卵子質(zhì)量。WOW法有助于促進(jìn)卵子成熟和胚胎發(fā)育,但是仍不能克服單卵、單胚發(fā)育的缺陷。
　　 第四部分:人單胚培養(yǎng)系統(tǒng)中受精時(shí)間對(duì)配子受精、胚胎質(zhì)量和妊娠結(jié)局的影響
　　 研究目的:
　　

20、評(píng)估短時(shí)受精技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)來(lái)證實(shí)短時(shí)受精-單胚培養(yǎng)技術(shù)在IVF臨床中的益處。
　　 研究對(duì)象和方法:
　　 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心的兩組女性患者,組Ⅰ,女方年齡<35歲,不孕期限<5年,男方精液常規(guī)正常(WHO,1999);組Ⅱ,女方年齡≥35歲,不孕期限≥5年,男方精液常規(guī)輕度異常。男方輕度異常,指精子濃度從10×106/mL～20×106/mL,和精子活動(dòng)率10%～25%,正常精子形態(tài)15%～30%(WHO,19

21、99)。
　　 分別采用短時(shí)受精(4小時(shí))和長(zhǎng)時(shí)受精(16-18小時(shí))方法。比較兩種方法的受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率、著床率等。
　　 研究結(jié)果:
　　 組1中,兩種受精方法的受精率、臨床妊娠率、著床率沒(méi)有明顯差別,但短時(shí)受精技術(shù)的多精受精率(7.3%)要明顯高于長(zhǎng)時(shí)受精組(4.1%)。組2中,短時(shí)受精的受精率(62.6%)要明顯低于長(zhǎng)時(shí)受精(68.7%)。短時(shí)受精失敗后行補(bǔ)救卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(intr