不同體外培養(yǎng)體系對胚胎發(fā)育的影響.pdf

1、胚胎質(zhì)量是影響體外受精(in vitro fertilization,IVF)結(jié)局的重要因素。而胚胎在生長發(fā)育過程中所處的局部微觀環(huán)境對胚胎質(zhì)量發(fā)揮著決定性作用。胚胎培養(yǎng)微環(huán)境最主要的構(gòu)成部分就是體外培養(yǎng)體系。如何建立最適宜胚胎生長發(fā)育的體外培養(yǎng)體系,是目前輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technologies,ART)領(lǐng)域研究的熱點之一。
　　 近些年來,隨著對培養(yǎng)微環(huán)境研究的進一步深入和認識的逐漸

2、加深,體外培養(yǎng)體系被不斷地改良更新。目前主要采用的是礦物油或者石蠟油覆蓋的微滴培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)胚胎。國內(nèi)外許多研究證實哺乳動物胚胎體外培養(yǎng)時,群組法培養(yǎng)要比單胚法培養(yǎng)獲得更高質(zhì)量的胚胎。然而發(fā)生機制仍然不清,可能與胚胎發(fā)育過程中自身分泌因子的相互作用有關(guān)。然而這些研究大多是數(shù)十年前進行的,最近幾年培養(yǎng)基和培養(yǎng)體系都有了很大幅度的更新,體外培養(yǎng)胚胎質(zhì)量和妊娠結(jié)局得到很大的改善。在現(xiàn)有的新培養(yǎng)條件下,體外受精胚胎是單獨培養(yǎng)或還是群組培養(yǎng),胚胎質(zhì)

3、量是否會受到培養(yǎng)體積和密度的影響等依然不明。
　　 盡管數(shù)量眾多的胚胎群組共同培養(yǎng)可能有助于胚胎發(fā)育,但這僅僅是用于實驗研究,并且群組培養(yǎng)無法追蹤個體胚胎的發(fā)育情況。商業(yè)化的培養(yǎng)系統(tǒng)或者人胚培養(yǎng)系統(tǒng)多要求胚胎單獨培養(yǎng)或者小數(shù)量胚胎群組培養(yǎng)。為了克服這些問題,Vaita等開發(fā)了微孔(the-well-of-the-well,WOW)培養(yǎng)系統(tǒng),為單獨培養(yǎng)的胚胎提供了半開放的培養(yǎng)微環(huán)境。微孔培養(yǎng)系統(tǒng)不僅稀釋了胚胎發(fā)育過程中堆積的代謝產(chǎn)

4、物的毒性作用,而且還將胚胎自分泌或者旁分泌的生長因子聚集在每個微孔內(nèi)的胚胎周圍,進而促進胚胎發(fā)育。目前關(guān)于微孔系統(tǒng)應(yīng)用于胚胎培養(yǎng)的研究相對較少,并且多集中于單微滴多微孔多胚胎培養(yǎng)研究,單微滴單微孔單胚胎培養(yǎng)未見報道,特別是對于超微滴體積下微孔培養(yǎng)系統(tǒng)對于胚胎發(fā)育的影響、微孔培養(yǎng)系統(tǒng)對玻璃化冷凍前后胚胎細胞凋亡的影響未見報道。
　　 從卵巢中獲取未成熟卵,在體外適宜的微環(huán)境和培養(yǎng)條件下培養(yǎng)成熟,從而具備受精和胚胎發(fā)育能力,即為卵母

5、細胞體外成熟(in vitro maturation,IVM)技術(shù)?；A(chǔ)研究和臨床實踐發(fā)現(xiàn),IVM來源的胚胎質(zhì)量差,囊胚形成率低,植入能力下降,妊娠結(jié)局欠佳。究其原因,可能與卵母細胞在體外培養(yǎng)時胞核和胞漿成熟不同步、卵子質(zhì)量較差有關(guān)。在研究中發(fā)現(xiàn),卵母細胞和其周圍的顆粒細胞通過內(nèi)分泌、自分泌、旁分泌的方式相互影響,相互作用。顆粒細胞分泌一些可溶性的營養(yǎng)物質(zhì)促進胞核和胞質(zhì)的成熟。是否可以利用WOW系統(tǒng)體外培養(yǎng)未成熟卵子以提高卵子質(zhì)量依然不

6、明確,相關(guān)研究未見報道。
　　 微滴法群組培養(yǎng)有利于提高胚胎的發(fā)育潛能,但是該培養(yǎng)方法無法追蹤胚胎的個體發(fā)育,同時過高的胚胎密度也容易導(dǎo)致代謝產(chǎn)物的堆積而增加培養(yǎng)微滴的毒性。微孔系統(tǒng)培養(yǎng)仍處于實驗研究階段,培養(yǎng)條件仍需要摸索。而且目前商品化的微孔培養(yǎng)用皿形式單一、規(guī)模較小,因此大多數(shù)生殖中心仍選擇單胚微滴法培養(yǎng)人的胚胎。傳統(tǒng)的單胚微滴法培養(yǎng)面臨著很多挑戰(zhàn),長時間的精卵孵育可以導(dǎo)致許多毒性物質(zhì)的堆積,阻礙早期胚胎的發(fā)育。許多研究提

7、出,IVF技術(shù)改良之一的選擇就是縮短受精時間,從16-18小時縮短至1-4小時。對于縮短精卵共孵育時間是否有利于胚胎發(fā)育仍存在爭議。
　　 本研究通過改變小鼠早期胚胎在微滴培養(yǎng)系統(tǒng)中的微滴體積、胚胎密度觀察評估胚胎發(fā)育結(jié)局;微孔培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)早期胚胎獲得囊胚行玻璃化冷凍,觀察冷凍前后囊胚細胞凋亡率的變化并評估技術(shù)安全性;微孔系統(tǒng)培養(yǎng)未成熟卵子并進行后續(xù)胚胎培養(yǎng),觀察評估微孔系統(tǒng)對卵子和胚胎的發(fā)育潛能的影響;人胚胎單胚培養(yǎng)系統(tǒng)中縮短

8、精卵共孵育時間觀察胚胎發(fā)育和妊娠結(jié)局等探索不同的體外培養(yǎng)體系對胚胎發(fā)育的影響。經(jīng)查新未見相同報道。
　　 第一部分:不同體積和胚胎密度的微滴和微孔培養(yǎng)系統(tǒng)對早期鼠胚發(fā)育的影響
　　 研究目的:
　　 探討早期小鼠2細胞胚胎的最佳培養(yǎng)微滴體積和胚胎密度,并評估胚胎共培養(yǎng)時間以及WOW培養(yǎng)系統(tǒng)對胚胎質(zhì)量的影響研究方法:
　　 (1)9個/微滴2細胞鼠胚分別在6.25、12.50、25.00和50.00μl微滴

9、中培養(yǎng);(2)3、6、9和12個2細胞鼠胚在50μl微滴中培養(yǎng);(3)9個/微滴2細胞胚胎在50μl的微滴中共培養(yǎng)0h、24h、48h、72h、96h;(4)9個/微滴2細胞胚胎分別在50μl微滴和WOW系統(tǒng)中培養(yǎng),單個鼠胚分別在5.5μl的微滴和WOW系統(tǒng)中培養(yǎng)。(5)單個2細胞鼠胚在1、2、5.5μl體積的WOW系統(tǒng)中培養(yǎng)。所有分組比較囊胚形成率、孵出率和囊胚細胞數(shù)目。
　　 結(jié)果:
　　 9個2細胞胚胎在50μl微

10、滴中培養(yǎng)囊胚形成率最高(84.7％)。與群組培養(yǎng)相比,單個胚胎培養(yǎng)囊胚形成率降低。胚胎共培養(yǎng)72-96h囊胚形成率增高,96h囊胚率為84.7%。與微滴法相比,單個胚胎在WOW系統(tǒng)中培養(yǎng)囊胚形成率無明顯差異。但群組培養(yǎng)的囊胚細胞數(shù)目明顯高于單個胚胎培養(yǎng)。另外,單個胚胎在WOW中培養(yǎng)獲得囊胚細胞數(shù)目明顯高于微滴法。單WOW系統(tǒng)體中微滴積縮小至1-2μl,囊胚形成率未發(fā)明顯差異,但是囊胚孵出率、細胞總數(shù)明顯增高。
　　 結(jié)論:

11、>　　 50μl微滴9個2細胞胚胎是群組培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)體積/密度。胚胎共同培養(yǎng)超過72h有利于改善胚胎發(fā)育潛能。50μl的WOW系統(tǒng)能夠改善胚胎質(zhì)量并追蹤個體胚胎發(fā)育,但是仍不能克服單胚發(fā)育的缺陷。微滴體積減少至1μl時有助于提高單獨培養(yǎng)胚胎的發(fā)育潛能。
　　 第二部分:微孔培養(yǎng)系統(tǒng)對小鼠囊胚玻璃化冷凍前后的細胞凋亡影響和技術(shù)安全性評估
　　 研究目的:
　　 通過比較群組培養(yǎng)系統(tǒng)和單胚培養(yǎng)系統(tǒng)、微滴法和WOW

12、法獲得的囊胚玻璃化冷凍前后的凋亡率的比較來判斷WOW培養(yǎng)系統(tǒng)對胚胎質(zhì)量和冷凍耐受力的影響。
　　 研究方法:
　　 第一部分實驗獲得群組培養(yǎng)、單胚培養(yǎng)、微滴法和WOW法的囊胚一部分行脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標記法(terminal-deoxynucleotidyltransferase mediated nick end labeling,TUNEL)染色,另一部分囊胚行玻璃化冷凍,解凍復(fù)蘇后孵育3-4h、

13、6-8h、16-18h、24h,行TUNEL染色。比較細胞凋亡率。
　　 結(jié)果:
　　 單微滴群胚微孔培養(yǎng)法與其他各組相比,各發(fā)育階段囊胚細胞凋亡率明顯較低。群組法WOW系統(tǒng)和非-WOW系統(tǒng)擴張期囊胚細胞凋亡率(10.3±3.0)%、(12.6±1.9)%明顯低于單胚培養(yǎng)組。解凍后完全擴張少于8h的囊胚細胞凋亡率隨孵育時間延長而無明顯變化。而完全擴張延遲超過8h的囊胚在培養(yǎng)16-18h、24h后細胞凋亡率(14.2±1:

14、4.9)%、(14.2±3.3)%明顯增加。移植玻璃化冷凍解凍后的WOW法獲得的囊胚妊娠后出生小鼠體重各組無明顯差異。子代雌鼠獲卵數(shù)、IVF受精率、囊胚形成率、孵出率無明顯差別。
　　 結(jié)論:
　　 WOW培養(yǎng)系統(tǒng)有利于改善胚胎質(zhì)量和提高囊胚冷凍耐受力,囊胚解凍后完全擴張延遲超過8h胚胎細胞凋亡率增加,胚胎發(fā)育潛能差。WOW法培養(yǎng)胚胎聯(lián)合玻璃化冷凍胚胎是安全有效的,對子代特別是雌鼠生殖能力無不良影響。
　　 第三

15、部分:顆粒細胞、成熟時間及微孔系統(tǒng)對卵子體外成熟及后續(xù)胚胎發(fā)育的影響
　　 研究目的:
　　 通過比較顆粒細胞、卵子成熟時間和體外培養(yǎng)系統(tǒng)對體外成熟卵子質(zhì)量、受精能力、胚胎發(fā)育潛能的影響,探討未成熟卵子體外成熟和后續(xù)胚胎發(fā)育的最佳培養(yǎng)微環(huán)境。
　　 研究方法:
　　 (1)240枚未成熟卵子隨機分為無顆粒細胞體外成熟組和有顆粒細胞體外成熟組,行體外成熟、受精、胚胎培養(yǎng);(2)282枚未成熟卵子分為24h培

16、養(yǎng)成熟組和48h培養(yǎng)成熟組,行體外受精和胚胎培養(yǎng);(3)259個未成熟卵子分為群組培養(yǎng)組(9個/微滴)和單獨培養(yǎng)組(1個/微滴),行體外成熟、受精、胚胎培養(yǎng)。(4)9個未成熟卵子及受精后的2細胞胚胎分別在50μl微滴和WOW系統(tǒng)中培養(yǎng),單個未成熟卵子及受精后的2細胞胚胎分別在5.5μl的微滴和WOW系統(tǒng)中培養(yǎng)。比較各組囊胚形成率、孵出率和囊胚細胞數(shù)目。
　　 結(jié)果:
　　 有顆粒細胞組卵子獲得胚胎囊胚形成率(34.0%)

17、和囊胚孵出率(72.2%)明顯高于無顆粒細胞組。經(jīng)24h培養(yǎng)成熟的卵子的胚胎卵裂率(64.6%)、囊胚形成率(37.5%)要明顯高于48h者。經(jīng)群組培養(yǎng)成熟的卵子與單卵培養(yǎng)成熟的卵子相比,成熟率(71.5%)、胚胎卵裂率(60.2%)、囊胚形成率(33.90%)要明顯增高。單胚培養(yǎng)組和群胚培養(yǎng)組相比,囊胚形成率明顯降低,而囊胚孵出率則無明顯差別。群胚培養(yǎng)時,采用WOW系統(tǒng)的囊胚形成率、囊胚孵出率與非-WOW系統(tǒng)沒有明顯區(qū)別。WOW系統(tǒng)中

18、群組培養(yǎng)組的囊胚細胞總數(shù)為49.2±9.2,高于單胚培養(yǎng)組的38.2±8.0,在非-WOW系統(tǒng)中群組的43.0±7.7也高于單胚組的34.4±2.3。群組培養(yǎng)WOW系統(tǒng)囊胚細胞總數(shù)49.2±9.2明顯高于非.WOW系統(tǒng)中的43.0±7.7。內(nèi)細胞團TE細胞總數(shù)37.7±9.2)要明顯多于非.WOW系統(tǒng)31.7±7.3。此外,單胚培養(yǎng)WOW系統(tǒng)的囊胚細胞總數(shù)49.2±9.2)明顯多于非-WOW系統(tǒng)43.0±7.7。相應(yīng)的WOW系統(tǒng)的ICM

19、/TE(32.6±9.0)%也要高于非-WOW系統(tǒng)(36.8±6.6)%。
　　 結(jié)論:
　　 顆粒細胞有利于提高群組培養(yǎng)的卵子質(zhì)量改善胚胎發(fā)育潛能。卵子體外成熟時間超過24h胚胎質(zhì)量變差。卵子群組培養(yǎng)有利于提高卵子質(zhì)量。WOW法有助于促進卵子成熟和胚胎發(fā)育,但是仍不能克服單卵、單胚發(fā)育的缺陷。
　　 第四部分:人單胚培養(yǎng)系統(tǒng)中受精時間對配子受精、胚胎質(zhì)量和妊娠結(jié)局的影響
　　 研究目的:
　　

20、評估短時受精技術(shù)的優(yōu)缺點來證實短時受精-單胚培養(yǎng)技術(shù)在IVF臨床中的益處。
　　 研究對象和方法:
　　 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心的兩組女性患者,組Ⅰ,女方年齡<35歲,不孕期限<5年,男方精液常規(guī)正常(WHO,1999);組Ⅱ,女方年齡≥35歲,不孕期限≥5年,男方精液常規(guī)輕度異常。男方輕度異常,指精子濃度從10×106/mL～20×106/mL,和精子活動率10%～25%,正常精子形態(tài)15%～30%(WHO,19

21、99)。
　　 分別采用短時受精(4小時)和長時受精(16-18小時)方法。比較兩種方法的受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率、著床率等。
　　 研究結(jié)果:
　　 組1中,兩種受精方法的受精率、臨床妊娠率、著床率沒有明顯差別,但短時受精技術(shù)的多精受精率(7.3%)要明顯高于長時受精組(4.1%)。組2中,短時受精的受精率(62.6%)要明顯低于長時受精(68.7%)。短時受精失敗后行補救卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(intr