操作液中不同添加物對(duì)豬ICSI影響及相關(guān)問(wèn)題研究.pdf

1、單精子胞質(zhì)內(nèi)顯微注射(ICSI)技術(shù)能夠提高配子利用率，獲取所需性別動(dòng)物，解決雄性動(dòng)物少精不孕問(wèn)題，作為輔助技術(shù)在轉(zhuǎn)基因工程研究領(lǐng)域具有重大作用。在實(shí)施ICSI操作過(guò)程中，通常在操作液中添加PVP(聚乙烯吡咯烷酮——一種高分子物質(zhì))來(lái)降低精子運(yùn)動(dòng)性，減少注射針與精子的粘連，便于操作。但是，PVP同精子一起注入到胞質(zhì)內(nèi)會(huì)包圍在精子周圍，不但使精子質(zhì)膜變得堅(jiān)韌影響破裂，影響精核解聚，而且阻礙精子向胞質(zhì)釋放使卵母細(xì)胞激活的精子蛋白，影響卵母細(xì)

2、胞的活化，使ICSI的成功率受到嚴(yán)重影響；但是，不添加PVP由于粘連會(huì)明顯增加顯微操作難度。 本試驗(yàn)針對(duì)ICSI技術(shù)存在的注射針粘連、卵膜柔韌程度、PVP物質(zhì)包繞精子、精子解聚困難和卵母細(xì)胞活化不足等問(wèn)題，通過(guò)研究ICSI操作液中防粘連物質(zhì)的使用和選擇可以替代PVP的新的生理性防粘連物質(zhì)，減少PVP所產(chǎn)生的不良影響，探索克服和解決這些ICSI技術(shù)問(wèn)題的方法，提高豬ICSI效果。 本試驗(yàn)?zāi)康氖茄芯孔鳛镻VP替代物質(zhì)的HA(

3、透明質(zhì)酸)，配合在操作液中使用CB(細(xì)胞松馳素B)，進(jìn)行豬ICSI操作的基本程序，通過(guò)減少傳統(tǒng)的在操作液中使用PVP存在的不良作用，提高豬ICSI胚胎發(fā)育率。試驗(yàn)首先通過(guò)傳統(tǒng)的方法，在操作液中添加PVP進(jìn)行ICSI操作，研究精子解聚和原核形成的時(shí)間；進(jìn)而研究ICSI后卵母細(xì)胞的電、化學(xué)激活方法；操作液中添加CB的輔助作用；在固定電、化學(xué)激活參數(shù)和原核觀察時(shí)間的基礎(chǔ)上，試驗(yàn)選擇和PVP有類似潤(rùn)滑作用的生理性物質(zhì)HA，分別對(duì)PVP和HA的適

4、宜操作濃度進(jìn)行了研究；最后以卵裂率、8-細(xì)胞以上胚胎發(fā)育率為指標(biāo)比較在最適PVP和HA濃度下兩種防粘連物質(zhì)對(duì)豬ICSI效果的影響。研究結(jié)果如下： 試驗(yàn)一：豬ICSI后精子解聚和原核形成時(shí)間觀察。采用豬精子進(jìn)行ICSI，分別于注射后7h、10h、13h、16h和19h通過(guò)熒光染色觀察精核解聚和原核形成情況。ICSI后7小時(shí)僅有5.2％的精子解聚，并未見(jiàn)到雌雄原核的形成。ICSI后10h，12.5％精子進(jìn)入解聚狀態(tài)；ICSI后13h

5、，處于精核解聚狀態(tài)的精子所占比率增至29.0％，有6.5％精子已經(jīng)形成雄原核；ICSI后16h，16.7％精子處于解聚狀態(tài)，雄原核形成率迅速增至28.8％；ICSI后19h，12.5％精子處于解聚狀態(tài)，41.7％精子形成雄原核。結(jié)果表明精核解聚主要發(fā)生在ICSI后13h-16h，雄原核形成率隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增。這為后面試驗(yàn)觀察解聚精子和原核形成提供了時(shí)間依據(jù)，觀察精核解聚和原核形成的時(shí)間為ICSI后16h為宜。 試驗(yàn)二：不同激活方

6、法對(duì)豬ICSI效果的影響。在本試驗(yàn)中，針對(duì)卵母細(xì)胞ICSI后活化不足的問(wèn)題，在ICSI后進(jìn)行一般性電激活(場(chǎng)強(qiáng)0.4KV/cm、脈沖時(shí)程90μs、一次脈沖)的基礎(chǔ)上，之后分為三組，對(duì)照組在電激活清洗后直接放胚胎液中培養(yǎng)；其他兩組分別在電激活后用2mmol/L6-DMAP、10ug/mlCHX處理6h，進(jìn)行化學(xué)補(bǔ)充激活，清洗后放入胚胎液中培養(yǎng)。結(jié)果表明，對(duì)照組卵裂率低于6-DMAP組和CHX組，與6-DMAP組差異極顯著(41.0％vs4

7、4.3％)(p＜0.01)，與CHX組差異顯著(41.0％vs43.5％)(p＜0.05)。對(duì)照組8-細(xì)胞以上胚胎數(shù)低于6-DMAP組和CHX組，與6-DMAP組差異極顯著(14.1％vs19.0％)(p＜0.01)，與CHX組差異顯著(14.1％vs17.6％)(p＜0.05)。6-DMAP組和CHX組之間卵裂率和8-細(xì)胞以上胚胎數(shù)無(wú)顯著差異(p＞0.05)。上述結(jié)果說(shuō)明：豬體外成熟卵母細(xì)胞ICSI后僅依靠電激活不足以使MII期中期的

8、卵母細(xì)胞活化，采用電激活+6-DMAP(或CHX)激活，能夠有效活化卵母細(xì)胞，降低MPF分子作用，從而提高ICSI胚胎的發(fā)育效果，后面試驗(yàn)均采用6-DMAP進(jìn)行化學(xué)補(bǔ)充激活。 試驗(yàn)三：操作液中添加CB對(duì)ICSI效果的影響。本試驗(yàn)針對(duì)注射精子時(shí)卵膜的脆弱易損問(wèn)題，比較在操作液中添加CB與對(duì)照組(不添加CB)的試驗(yàn)效果。試驗(yàn)組卵裂率高于未加CB組的對(duì)照組(46.7％vs43.7％)，差異顯著(p＜0.05)，試驗(yàn)組8-細(xì)胞以上胚胎數(shù)

9、高于對(duì)照組(18.7％vs18.3％)，差異不顯著(p＞0.05)，說(shuō)明注射卵母細(xì)胞的操作液中添加CB不但能夠使操作容易進(jìn)行，而且還可以改善豬ICSI受精卵的卵裂效果。 試驗(yàn)四：操作液中添加不同濃度PVP對(duì)ICSI效果的影響。試驗(yàn)選擇5％和10％兩組PVP濃度進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明兩組解聚精子數(shù)無(wú)顯著差異(16.5％vs16.8％)(p＞0.05)，5％PVP組雄原核形成數(shù)高于10％PVP組(28.7％vs23.7％)，差異顯著(p

10、＜0.05)，5％PVP組卵裂率高于10％PVP組，差異顯著(46.7％vs42.2％)(p＜0.05)，5％PVP組8-細(xì)胞以上胚胎數(shù)略高于10％PVP組，差異不顯著(18.7％vs17.6％)(p＞0.05)。結(jié)果說(shuō)明降低PVP濃度有利于雄原核形成，能夠提高豬ICSI卵的卵裂率。 試驗(yàn)五：操作液中添加不同濃度HA對(duì)ICSI效果的影響。試驗(yàn)選擇在操作液中添加0.5mg/ml、1.Smg/ml和2.5mg/ml三組HA濃度進(jìn)行試

11、驗(yàn)，結(jié)果表明三組解聚精子數(shù)(16.0％Vs15.7％，16.2％)和雄原核形成數(shù)(30.2％vs30.4％，29.3％)無(wú)顯著差異(p＞0.05)。0.5mg/mlHA組卵裂率低于其他兩組，差異極顯著(46.0％vs50.1％，49.6％)(p＜0.01)，1.5mg/mlHA組與2.5mg/mlHA組卵裂率(50.1％vs49.6％)和8-細(xì)胞以上胚胎數(shù)(22.4％vs21.2％)差異不顯著(p＞0.05)，0.5mg/mlHA組8-

12、細(xì)胞以上胚胎數(shù)最低。操作液中添加1.5mg/mlHA更有利于注射卵的發(fā)育。 1.5mg/mlHA組和5％PVP組相比較，操作過(guò)程中潤(rùn)滑作用相似，兩組解聚精子比率之間無(wú)顯著差異(p＞0.05)；HA組雄原核形成率、卵裂率、8-細(xì)胞以上胚胎數(shù)都顯著高于PVP組(30.4％vs28.7％)(50.1％vs46.7％)(22.4％vs18.75％)(p＜0.05)。結(jié)果表明，操作液中用1.5mg/mlHA代替5％PVP更有利于注射卵的發(fā)

13、育。 結(jié)論：豬ICSI操作過(guò)程中，操作液中添加CB，并且用1.5mg/mlHA代替5％PVP，電激活后再用6-DMAP處理6h對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行化學(xué)補(bǔ)充激活能夠明顯改善豬ICSI胚胎的發(fā)育效果。與傳統(tǒng)的在豬ICSI操作液中添加PVP的方法相比，從精子解聚、原核形成、卵裂率、8-細(xì)胞以上胚胎數(shù)等多方面統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，所選擇的HA不但能夠像PVP一樣增加潤(rùn)滑程度、減少精子對(duì)注射針的粘附，而且還使精、卵之間的互作加強(qiáng)，豬ICSI效果明顯