間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基通過NLRP3炎癥小體增加胰島素敏感性的機制研究.pdf

1、目的:①探討分離大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的方法并鑒定其相關(guān)表型，收集培養(yǎng)的上清液并將其制備成濃縮條件培養(yǎng)基保存?zhèn)溆?。②證實NLRP3炎癥小體及其下游分子在游離脂肪酸(FFA)和脂多糖(LPS)誘導HepG2細胞胰島素抵抗過程中的表達情況。③初步明確PA和LPS能夠通過慢性炎癥過程誘導胰島素抵抗，進一步探討B(tài)MSCs-CM通過作用于NLRP3、IL-1β、IL-18及TNF-α所致炎癥反應而提高HepG2細胞胰島素敏感性的可能機制。
　

2、　方法:首先，常規(guī)無菌條件下分離、培養(yǎng)并鑒定BMSCs，通過貼壁培養(yǎng)法對其進行純化，傳代并收集第2-4代細胞的條件培養(yǎng)基，進一步將其進行濃縮處理。進一步將實驗分為5組:以正常HepG2細胞作為空白對照，分別以BSA、PA、LPS及PA+LPS作為造模組，根據(jù)各組內(nèi)葡萄糖利用情況篩選出最佳造模劑使用濃度及作用時間，同時測定造模組內(nèi)炎癥因子的表達量。最后，在慢性炎癥誘導胰島素抵抗成功的基礎(chǔ)上加入BMSCs-CM，同時以加入同樣經(jīng)半透膜濃縮后

3、的無血清L-DMEM作為陰性對照，分別采用葡萄糖及糖原檢測試劑盒來分析各組葡萄糖利用情況;ELISA觀察各組炎癥因子的表達量;采用qRT-PCR方法來分析細胞內(nèi)相關(guān)基因的表達;Western blot檢測BMSCs-CM對胰島素發(fā)揮作用的靶蛋白基因的表達的影響。
　　結(jié)果:成功培養(yǎng)BMSCs并對收集的上清液進行了濃縮條件培養(yǎng)基的配制;構(gòu)建了慢性炎癥誘導的HepG2細胞胰島素抵抗模型，造模組胞內(nèi)糖原含量明顯減低而培養(yǎng)基中葡糖糖的含量

4、則較空白組顯著增多;而在加入BMSCs-CM后上述葡萄糖代謝水平均得到了提高，ELISA及qRT-PCR法分別從蛋白質(zhì)的分泌和基因表達兩個水平說明間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基能夠發(fā)揮抗炎作用，Western blot結(jié)果提示，與胰島素抵抗組相比，BMSCs-CM組HepG2細胞內(nèi)的胰島素作用蛋白表達得到了恢復。
　　結(jié)論:本研究表明BMSCs-CM可以通過調(diào)控NLRP3炎癥小體及其下游相關(guān)炎癥因子的表達來發(fā)揮增加葡萄糖攝取及利用的作用，