體外組蛋白去乙?；?(HDAC1)過表達(dá)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞化療耐藥的實驗研究.pdf

1、乳腺癌是全世界發(fā)病率和死亡率最高的婦科惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性的健康與生命。臨床治療中面臨的最大挑戰(zhàn)是治療藥物的耐藥性問題，約有一半的患者在起初有效的化療之后慢慢出現(xiàn)藥物耐受，從而導(dǎo)致治療失敗。組蛋白去乙酰化作為一種重要的表觀遺傳修飾，參與了許多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。HDAC1是目前為止發(fā)現(xiàn)的與腫瘤關(guān)系最密切的組蛋白去乙?；?，與細(xì)胞周期、分化、增殖和有絲分裂等生物過程調(diào)節(jié)關(guān)系緊密。但有關(guān)HDAC1與乳腺癌化療耐藥的作用機制尚不清楚，亦未見

2、研究報道。本實驗擬建立HDAC1過表達(dá)慢病毒載體，構(gòu)建HDAC1穩(wěn)定過表達(dá)的乳腺癌MCF-7細(xì)胞系，觀察HDAC1過表達(dá)對MCF-7細(xì)胞耐藥程度的改變，評價HDAC1的穩(wěn)定過表達(dá)的MCF-7細(xì)胞對化療藥物的抗凋亡作用及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，為提高化療效果、減少化療藥物用量奠定基礎(chǔ)。
　　目的:
　　研究HDAC1的過表達(dá)的MCF-7細(xì)胞對化療藥物的抗凋亡作用，探討其與乳腺癌化療耐藥的關(guān)系。
　　方法:
　　1、

3、HDAC1基因過表達(dá)重組慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定
　　構(gòu)建包含HDAC1基因的過表達(dá)慢病毒載體并進(jìn)行鑒定，包裝出慢病毒，轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞建立HDAC1穩(wěn)定過表達(dá)的MCF-7細(xì)胞系，We stern b lot檢測HDAC
　　蛋白表達(dá)情況。
　　構(gòu)建HDAC1過表達(dá)慢病毒載體通過從乳腺癌細(xì)胞系中提取總RNA，RT-PCR、TA克隆、酶切鑒定及測序分析鑒定HDAC1基因，將HDAC1與pCDH-CMV-MCS-EF1-P

4、uro慢病毒載體連接，包裝病毒，感染乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，嘌呤霉素篩選，建立HDAC1穩(wěn)定過表達(dá)的MCF-7細(xì)胞系。
　　2、HDAC1過表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞系化療藥物耐藥程度的影響
　　探討HDAC1過表達(dá)MCF-7細(xì)胞與腫瘤化療耐藥的關(guān)系，實驗細(xì)胞MCF-7-HDAC1和MCF-7-Control細(xì)胞分為未施加藥物對照組（Control組）、VM-26（替尼泊苷）、DDP（順鉑）及THP（吡柔比星）組，共4組。對照組加入含

5、10％FBS的DMEM培養(yǎng)基;VM-26組設(shè)置終濃度為0.39、0.78、1.56、3.12μg/mL的4個藥物濃度梯度，作用48h;DDP組設(shè)置終濃度為0.3125、0.625、1.25、2.5μg/mL的4個濃度梯度，作用48h。THP組設(shè)置終濃度為0.39、0.78、1.56μg/mL的3個濃度梯度，作用72h。通過MTT檢驗MCF-7細(xì)胞耐藥性的改變;Hoechst33258/PI雙染色、流式AnnexinⅤ/PI檢測HDAC1

6、過表達(dá)MCF-7細(xì)胞的凋亡率;Western blot檢測Bcl-2/Bax、Caspase3表達(dá)，研究HDAC1過表達(dá)MCF-7細(xì)胞化療對藥物耐受程度的改變，并初步探討其作用機制。
　　結(jié)果:
　　1、HDAC1基因過表達(dá)重組慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定
　　擴(kuò)增HDAC1基因并構(gòu)建了pCDH-CMV-MCS-HDAC1-EF1-Puro慢病毒表達(dá)質(zhì)粒體，成功建立HDAC1穩(wěn)定過表達(dá)的MCF-7細(xì)胞系，Western bl

7、ot檢測能夠過表達(dá)HDAC1。
　　2、HDAC1過表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞系化療藥物耐藥程度的影響
　　給予VM-26、DDP、THP處理MCF-7細(xì)胞后，可濃度依賴性地降低MCF-7細(xì)胞存活率(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)，與MCF-7-Control細(xì)胞相比，VM-26、DDP、THP各濃度下MCF-7-HDAC1細(xì)胞的存活率明顯較高，MCF-7-HDAC1與MCF-7-Control細(xì)胞IC50（半數(shù)抑制濃度

8、）分別為(18.861vs14.906，18.310vs11.589，8.225vs5.144);Hoechst33258/PI雙染觀察到三種藥物促使細(xì)胞核凝聚固縮，使細(xì)胞碎片增多，細(xì)胞死亡增多，與MCF-7-Control細(xì)胞相比，HDAC1過表達(dá)MCF-7細(xì)胞核固縮凝聚減輕，細(xì)胞死亡數(shù)減少;而流式FITC-AnnexinⅤ/PI雙染觀察到三種藥物處理MCF-7細(xì)胞細(xì)胞凋亡率濃度依賴性升高(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)

9、，與MCF-7-Control細(xì)胞相比，凋亡率明顯降低(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)，具有統(tǒng)計學(xué)差異;Western blot結(jié)果顯示，隨著三個藥物組濃度的增加，MCF-7細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)減少，Bax蛋白表達(dá)逐漸增多，Bcl-2/Bax比值明顯降低(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)，Caspase3表達(dá)明顯增加(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)，與MCF-7-Control細(xì)胞相比，MCF-

10、7-HDAC1細(xì)胞Bcl-2/Bax比值顯著性增加(P＜0.001)，Caspase3表達(dá)明顯降低(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)。
　　結(jié)論:
　　1、成功構(gòu)建了HDAC1慢病毒重組表達(dá)載體，建立HDAC1穩(wěn)定過表達(dá)的MCF-7細(xì)胞系。
　　2、HDAC1的過表達(dá)具有提高M(jìn)CF-7細(xì)胞化療后藥物存活率，降低VM-26、DDP、THP等抗腫瘤藥物所致的凋亡作用。
　　3、在所選用的VM-26（替尼泊