ANXA2在視網(wǎng)膜新生血管形成過程中的表達(dá)及作用機(jī)制.pdf

1、目的：通過觀察ANXA2在體外高糖培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Humanumbilicalveinendothelialcells,HIJVEC)及氧誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠視網(wǎng)膜新生血管中的表達(dá),研究ANXA2對HUVEC增殖,遷移,成管能力的影響,對小鼠視網(wǎng)膜新生血管發(fā)育的影響,以及對新生血管相關(guān)因子表達(dá)的調(diào)控,探討ANXA2在視網(wǎng)膜新生血管形成過程中的作用和機(jī)制。
　　 方法：(1)體外實驗應(yīng)用HUVEC細(xì)胞,實驗分四組:正常

2、組(Normall,常規(guī)培養(yǎng)),高糖培養(yǎng)下的高糖對照組(Mock,無處理)、陰性干擾組(SiControl)、陽性干擾組(SiANXA2)。應(yīng)用Real-timePCR和Westernblot方法檢測各實驗組HUVEC中膜聯(lián)蛋白A2(ANXA2)基因及蛋白的表達(dá)情況,MTT方法檢測各組0h,24h,48h和72h細(xì)胞增殖能力,劃痕實驗觀察各實驗組細(xì)胞遷移能力,成管實驗評估細(xì)胞的成管能力。并通過Real-timePCR檢測各實驗組中新生血

3、管相關(guān)因子VEGFA,MMP2,MMP9,TIMP2的mRNA表達(dá)情況。
　　 (2)體內(nèi)實驗應(yīng)用C57BL/6J小鼠。小鼠出生后7天,放入氧濃度75-80%氧箱內(nèi)5天后取出正常環(huán)境下飼養(yǎng),構(gòu)建氧誘導(dǎo)(OIR)小鼠模型。實驗分四組:正常組(Normal,正常飼養(yǎng)),OIR空白對照組(Mock,無處理),OIR陰性干擾組(SiANXA2_M)、和OIR陽性干擾組(SiANXA2)。分別取正常組和OIR空白對照組出生后12,13,1

4、4,15,16,17,21,30天小鼠,異硫氰酸標(biāo)記的右旋糖酐(FD-2000S)行上腔靜脈灌注,視網(wǎng)膜鋪片,熒光顯微鏡對比觀察氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管形態(tài)學(xué)變化,應(yīng)用Real-timePCR檢測對比兩組間相應(yīng)日齡小鼠視網(wǎng)膜ANXA2mRNA的表達(dá)變化。選擇小鼠出生后17天(P17)時間點,分別提取4組中小鼠視網(wǎng)膜標(biāo)本,通過視網(wǎng)膜鋪片方法對比觀察視網(wǎng)膜新生血管形態(tài)學(xué)變化,Real-timePCR及Westernblot檢測各組中ANXA2的

5、表達(dá)及ANXfi2基因干擾后新生血管相關(guān)因子Vegfa,Mmp2,Mmp9,Timp2的表達(dá)變化。應(yīng)用SPSS軟件對數(shù)據(jù)行統(tǒng)計學(xué)處理,應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行組間比較(P＜0.05)。
　　 結(jié)果：(1)體外實驗:高糖對照組HUVEC中ANXA2表達(dá)顯著高于正常組(P＜0.05)。高糖對照組HUVEC的增殖,細(xì)胞遷移數(shù)量(102.3±4.9VS50.3±2.5)和成管數(shù)量(17.3±1.5VS10±1.4)以及VEGFA,MMP2

6、,iMP9和TIMP2的mRNA表達(dá)均顯著高于正常組(P＜0.05)。基因干擾后,在基因和蛋白水平均表明ANXA2在陰性干擾組表達(dá)無明顯改變,在陽性干擾組表達(dá)有明顯下降,SiANXA2可以成功干擾.ANXA2基因的表達(dá)。ANXA2基因表達(dá)下降后,HUVEC的增殖、細(xì)胞遷移數(shù)量(41.1±1.5VS102.3±4.9)和成管數(shù)量(7.6±1.2VS17.3±1.5)顯著下降,VEGFA,MMP2,MMP9,TIMP2表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.

7、05)。
　　 (2)體內(nèi)實驗:ANXA2在視網(wǎng)膜血管發(fā)育旺盛期高表達(dá),在平緩期低表達(dá)。P17小鼠視網(wǎng)膜鋪片發(fā)現(xiàn),與OIR空白對照組和OIR陰性干擾組相比,OIR陽性干擾組視網(wǎng)膜新生血管迂曲現(xiàn)象減輕,血管滲漏較少,微血管瘤及新生血管芽減少。視網(wǎng)膜層次較明顯。OIR空白對照組ANXA2表達(dá)顯著高于正常組(P＜0.05)。ANXA2基因沉默后,ANXA2在OIR陽性干擾組表達(dá)有明顯下降(P＜0.05)。Vegfa,Mmp2,Mmp9