利用不同底物生產(chǎn)1,3-丙二醇及基因工程菌的構(gòu)建.pdf

1、1，3-丙二醇是一種重要的化工原料，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等多個領(lǐng)域，其中1，3-丙二醇最重要的用途是作為合成新型聚酯材料聚對苯二甲酸丙二醇酯(PTT)的單體。但目前只有化學法實現(xiàn)了1,3-丙二醇工業(yè)化生產(chǎn)。與化學法相比，微生物法具有反應(yīng)條件溫和、對環(huán)境條件友好等優(yōu)點受到廣泛重視。迄今為止，自然界中的微生物只能以甘油為底物發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇，由于原料成本較高，與化學法相比，微生物法制備1，3-丙二醇仍不具有競爭優(yōu)勢。為此，論文圍繞“提

2、高生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本”的研究目標，分別以Klebsiella pneumoniae，模式菌株Saccharomyces cerevisiae W303-1A和工業(yè)化甘油生產(chǎn)菌株Candida glycerinogenes為研究對象，采用基因工程、代謝工程和發(fā)酵工程等生物技術(shù)手段開展了應(yīng)用微生物法生產(chǎn)1,3-丙二醇的研究，取得了以下主要研究成果：
　　 1)為降低K． pneumoniae產(chǎn)1,3-丙二醇過程中由中間產(chǎn)物3-羥

3、基丙醛（3-HPA）累積對菌體生長和發(fā)酵的不利影響，以氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因cat為報告基因，成功構(gòu)建了K． pneumoniae新型表達系統(tǒng)pETPkan，并應(yīng)用該表達系統(tǒng)在K． pneumoniae中過量表達了1,3-丙二醇氧化還原酶基因dhaT，構(gòu)建了重組菌K． pneumoniae/pETPkan-dhaT。在發(fā)酵過程中，重組菌3-HPA的最大積累量與原始菌株相比，降低了約3倍，從而有效的促進了菌體生長、甘油消耗和產(chǎn)物合成，最終1

4、,3-丙二醇產(chǎn)量為28.9g/L，比野生菌提高了16.5％。
　　 2)考察了搖瓶水平上初始甘油、氮源、無機鹽等培養(yǎng)條件和pH、溫度、接種量等發(fā)酵工藝條件對重組菌K．pneumoniae/pETPkan-dhaT甘油轉(zhuǎn)化率和菌體生長的影響，通過單因素和正交實驗設(shè)計，優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基組成：甘油60g/L，酵母膏7g/L，(NH4)2SO40.3g/L，檸檬酸8g/L;優(yōu)化了發(fā)酵工藝條件：初始pH7.0，培養(yǎng)溫度30℃，裝液量50m

5、L/250mL三角瓶，發(fā)酵接種量(v/v)6％。在優(yōu)化的培養(yǎng)和工藝條件下，重組菌的1，3-丙二醇產(chǎn)量達到37.7g/L，甘油質(zhì)量轉(zhuǎn)化率提高至62.8％。考察了7L發(fā)酵罐上攪拌速度對1,3-丙二醇分批發(fā)酵實驗的影響，在300r/min的條件下，1,3-丙二醇濃度、甘油轉(zhuǎn)化率分別最高達36.4g/L,60％。7L發(fā)酵罐補料分批發(fā)酵實驗，發(fā)酵45h后測得1,3-丙二醇產(chǎn)量為62.2g/L。
　　 3)利用C glycerinogene

6、s生產(chǎn)的不同類型的甘油替代重組菌發(fā)酵培養(yǎng)基中的純甘油。首先以C. glycerinogenes甘油發(fā)酵液直接作為原料，發(fā)酵結(jié)果顯示，甘油發(fā)酵液中乙醇、乙酸等物質(zhì)影響了菌體的生長和甘油的消耗，發(fā)酵50h1,3-丙二醇產(chǎn)量僅為8.9g/L:在添加NaCl維持高滲條件下，Cglycerinogenes發(fā)酵培養(yǎng)基初始葡萄糖濃度的降低有效減少了乙醇、乙酸的生成，以此發(fā)酵液作為重組菌K． pneumoniae/pETPkan-dhaT發(fā)酵底物，發(fā)酵

7、40h后，1,3-丙二醇產(chǎn)量為24.7g/L;最后選擇工業(yè)級甘油為底物發(fā)酵產(chǎn)1,3-丙二醇，測得1.3-丙二醇含量為33.5g/L，甘油質(zhì)量轉(zhuǎn)化率為55.8％。以工業(yè)級甘油為原料，K． pneumoniae/pETPkan-dhaT7L發(fā)酵罐補料分批發(fā)酵，1,3-丙二醇產(chǎn)量達57.8g/L。以上實驗結(jié)果說明工業(yè)級甘油可成為替代純甘油發(fā)酵的廉價原料。
　　 4)首先克隆了K． pneumoniae甘油合成1,3-丙二醇途徑中8.0

8、kb左右大小的dha操縱子，并在大腸桿菌JM109中進行了有效表達，測得甘油脫水酶(GDHt)和1，3-丙二醇氧化還原酶(PDOR)比酶活分別為1.8U/mg和0.8U/mg，攜帶dha操縱子的大腸桿菌在以甘油為底物發(fā)酵時，可合成8.6g/L1，3-丙二醇；直接將8.0kbdha操縱子在模式菌株釀酒酵母S．cerevisiae W303-1A中表達，由于GDHt和PDOR比酶活僅有0.4U/mg和0.3U/mg，最終導(dǎo)致在以葡萄糖為底物

9、的發(fā)酵液中未檢測到1,3-丙二醇；為增強dha基因在S. cerevisiae W303-1A中的表達，將dhaB和dhaT基因分別置于啟動子GAP和轉(zhuǎn)錄終止子AOX1TT之間，利用游離型表達載體pYX212-zeocin在釀酒酵母中串聯(lián)表達，測得重組釀酒酵母W303-BT的GDHt和PDOR比酶活分別為15.1U/mg和12.3U/mg;W303-BT直接以葡萄糖為底物發(fā)酵，最終測得1，3-丙二醇產(chǎn)量為1.2g/L。
　　 5

10、)將dha操縱子上的基因片段dha1(dhaT+gdrB)和dha2(dhaB+gdrA)分別置于啟動子pGAP和AOX1TT之間，構(gòu)建表達元件pGAP-dha1-AOX1TT和pGAP-dha2-AOX1TT并串聯(lián)在根癌農(nóng)桿菌雙元載體pCAM3300-zeocin的T-DNA區(qū)域內(nèi)，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGAP4。將質(zhì)粒pGAP4電擊導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法(ATMT)轉(zhuǎn)化C.glycerinogenes，經(jīng)

11、表型及PCR、Southem Blot驗證后將遺傳穩(wěn)定的重組產(chǎn)甘油假絲酵母WL2002-GAP進行酶活檢測，測得GDHt和PDOR比酶活分別為1.9U/mg和1.4U/mg，以葡萄糖為底物發(fā)酵，最終測得1，3-丙二醇含量為2.9g/L。
　　 6)將質(zhì)粒pGAP4中的啟動子pGAP替換為來源于C．glycerinogenes的鹽壓誘導(dǎo)型啟動子Pcggpdl，構(gòu)建了質(zhì)粒pGPD4。進一步通過ATMT獲得了遺傳穩(wěn)定的重組產(chǎn)甘油假絲酵

12、母WL2002-GPD，測得其GDHt和PDOR比酶活分別為5.1U/mg和3.7U/mg,較WL2002-GAP分別提高約2.7倍和2.6倍；以葡萄糖為底物發(fā)酵測得1,3-丙二醇為6.7g/L，較WL2002-GAP提高約2.3倍。
　　 7)應(yīng)用重組產(chǎn)甘油假絲酵母WL2002-GPD分別在發(fā)酵培養(yǎng)基添加0.5mol/L和1mol/L NaCl的條件下發(fā)酵。結(jié)果表明，與未添加NaCl的發(fā)酵相比，隨著發(fā)酵培養(yǎng)基中NaCl濃度的增