產(chǎn)1，3-丙二醇新型基因工程菌的構建及其轉化甘油的研究.pdf

1、1，3-丙二醇是目前國際上公認的六大石化新產(chǎn)品之一，其主要功能是作為合成聚酯、聚醚和聚亞氨酯的單體。1，3-丙二醇的生產(chǎn)方法有化學合成法和微生物轉化法，由于從自然界中篩選的微生物厭氧發(fā)酵甘油生產(chǎn)1，3-丙二醇還存在產(chǎn)物濃度低、生產(chǎn)周期長和轉化率低等問題，目前僅有化學合成法應用于工業(yè)生產(chǎn)。因此，利用基因工程技術構建高產(chǎn)菌株備受國內(nèi)外研究者青睞，被認為是今后的發(fā)展方向；本研究的目的是構建新型好氧發(fā)酵基因工程菌，提高1，3-丙二醇的產(chǎn)量或轉化

2、率，為實現(xiàn)微生物法工業(yè)化生產(chǎn)1，3-丙二醇打下基礎。 本研究首次利用PCR方法從從大腸桿菌中克隆1.16kb的1，3-丙二醇氧化還原酶同工酶的編碼基因yqhD及2.80kb來源于弗氏檸檬桿菌甘油脫水酶的編碼基因dhaB，構建了重組菌E.coliJM109(pUCtac-dhaB-yqhD)。并對重組菌E.coliJM109、E.coliJM109(pEtac-yqhD)、E.coliJM109(pUCtac-dhaB)、E.co

3、liJM109(pUCtac-dhaB-dhaT)、E.coliJM109(pUCtac-dhaB-yqhD)及C.freundii好氧發(fā)酵甘油生產(chǎn)1，3-丙二醇的性能進行了初步考察。結果表明，在E.coliJM109中分別只引入甘油脫水酶dhaB基因或1，3-丙二醇氧化還原酶同工酶yqhD基因得到的重組菌E.coliJM109(pEtac-yqhD)及E.coliJM109(pUCtac-dhaB)均不能利用甘油合成1，3-丙二醇，只

4、有在E.coliJM109中同時引入dhaB基因和yqhD基因時才能利用甘油轉化為1，3-丙二醇，進一步證實1，3-丙二醇氧化還原酶的同工酶可在大腸桿菌體內(nèi)代替1，3-丙二醇氧化還原酶催化3-羥基丙醛生成1，3-丙二醇。在含甘油50g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，重組菌E.coliJM109(pUCtac-dhaB-yqhD)經(jīng)IPTG誘導后的1，3-丙二醇產(chǎn)量為28.0g/L，而E.coliJM109(pUCtac-dhaB-dhaT)1，3-

5、丙二醇的產(chǎn)量為8.2g/L。 1，3-丙二醇氧化還原酶的同工酶代替1，3-丙二醇氧化還原酶(編碼基因dhaT)催化3-羥基丙醛生成1，3-丙二醇的效率明顯提高，然而重組質(zhì)粒pUCtac-dhaB-yqhD需經(jīng)IPTG誘導才能表達外源基因，相對工業(yè)化生產(chǎn)而言，IPTG較為昂貴，因此解決誘導體系的問題顯得尤為重要。本研究采用溫控表達載體pHsh構建了產(chǎn)1，3-丙二醇重組菌E.coliJM109(pHsh-dhaB-yqhD)，并對重

6、組菌E.coliJM109(pUCtac-dhaB-yqhD)和E.coliJM109(pHsh-dhaB-yqhD)發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇的性能進行了初步考察。結果表明，溫度誘導與IPTG誘導相比1，3-丙二醇的產(chǎn)量無顯著差別，在含甘油50g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，重組菌E.coliJM109(pUCtac-dhaB-yqhD)與E.coliJM109(Hsh-dhaB-yqhD)經(jīng)誘導后1，3-丙二醇的產(chǎn)量分別為28.4g/L及26.5

7、g/L。因此，利用溫控載體構建產(chǎn)1，3-丙二醇重組菌有利于降低1，3-丙二醇的生產(chǎn)成本。 實驗發(fā)現(xiàn)，甘油脫水酶在催化甘油轉化為3-羥基丙醛的同時，會出現(xiàn)甘油導致的自殺性失活現(xiàn)象，且不因甘油脫水酶輔酶維生素B12濃度的增加而得到解除，可能需要某種激活因子的協(xié)同作用，而dhaG及dhaF是甘油脫水酶激活因子編碼基因。本研究利用PCR技術擴增出dhaG及dhaF，然后將它們與pHsh-dhaB-yqhD串聯(lián)表達，成功構建了新型產(chǎn)1，3

8、-丙二醇重組菌E.coliJM109(pHsh-dhaB-dhaG-dhaF-yqhD)。 對重組菌E.coliJM109(pHsh-dhaB-dhaG-dhaF-yqhD)和E.coliJM109(pHsh-dhaB-yqhD)進行酶活測定。結果發(fā)現(xiàn)，重組菌E.coliJM109(pHsh-dhaB-dhaG-dhaF-yqhD)和E.coliJM109(pHsh-dhaB-yqhD)甘油脫水酶酶活力分別為330U/mg蛋白、

9、210U/mg蛋白，其活力水平因激活因子的存在提高了1.57倍；而1，3-丙二醇氧化還原酶同工酶酶活力分別為105U/mg蛋白、110U/mg，其活力基本沒有變化。同時，發(fā)酵結果也表明，重組菌E.coliJM109(pHsh-dhaB-dhaG-dhaF-yqhD)比E.coliJM109(pHsh-dhaB-yqhD)1，3-丙二醇的產(chǎn)量提高了28.07％。 通過響應面分析法優(yōu)化了重組菌E.coliJM109(pHsh-dha

10、B-dhaG-dhaF-yqhD)的發(fā)酵培養(yǎng)基，其適宜的組成為：甘油61.80g/L、維生素B120.049g/L、KH2PO47.41g/L及酵母膏6.20g/L，響應面模型預測1，3-丙二醇的最大產(chǎn)量為43.86g/L，驗證性實驗證明應用此培養(yǎng)基1，3-丙二醇的產(chǎn)量為43.10g/L。在5L發(fā)酵罐上進行放大實驗，發(fā)酵結束后1，3-丙二醇的產(chǎn)量、轉化率和生產(chǎn)能力分別達到43.26g/L、72.20％和1.55g/(L·h)。

11、為解決重組菌E.coliJM109(pHsh-dhaB-dhaG-dhaF-yqhD)在發(fā)酵過程中存在的底物、產(chǎn)物抑制問題，本研究對重組菌細胞的固定化發(fā)酵進行了初步探索。利用正交設計確定了影響重組菌E.coliJM109(pHsh-dhaB-dhaG-dhaF-yqhD)固定化的主要因素海藻酸鈉、氯化鈣的最佳濃度均為20g/L而包埋量為15mL菌懸液/35mL凝膠，此時固定化重組菌細胞具有較高的轉化率和適宜的機械強度。然后，考察了初始甘